雌、孕激素對內皮素-1誘導的心肌細胞肥大反應的影響.pdf

1、心肌肥大是導致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增高的獨立危險因子，是心力衰竭的前驅病變，其潛在危害已越來越受到重視。目前己明確內皮素-1(endothelin-1，ET-1)是心肌細胞強大的促生長因子，可作為重要的致肥厚因子參與心肌細胞肥大反應。深入探討心肌肥大的發(fā)病機制、尋求合理有效的防治措施是心血管領域長期關注的重大研究課題。研究證實，雌激素對心臟具有保護效應，可以通過抗高血壓、對心臟的直接作用(通過雌激素受體)以及觸發(fā)一些心臟保護因子的釋

2、放等來抑制多種刺激因素所致的心肌肥大反應，但是其具體機制至今尚未完全闡明。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)家族是目前發(fā)現的最重要的生長信號調節(jié)蛋白，屬絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族，廣泛分布于細胞漿內，其成員細胞外信號調節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinases，ERK1/2，p42/p44MAPK)與細胞生長、分

3、化和增殖的調控關系尤為密切。MAPKs激活在細胞信號轉導方面有兩個重要特征：(1)激活核轉錄因子，促進轉錄；(2)整合不同受體系統(tǒng)介導的信息，起著多種信號共同通路的作用。我室既往的研究證實，ET-1誘導的心肌肥大反應與ERK1/2信號通路有關；而且在對血管的研究中也發(fā)現，17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)可以通過抑制ERK1/2的活性和蛋白表達來抑制血管損傷后血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecel

4、l，VSMC)的增殖。這就提示我們E2也可能通過調節(jié)ERK1/2的活性和蛋白表達來抑制ET-1誘導的心細胞肥大反應。 ERK1/2激活后主要被細胞內的磷酸酶去磷酸化而失活。在心肌細胞，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activatedproteinkinasephosphatase-1，MKP-1)為目前發(fā)現的最重要的MAPK磷酸酶，對ERK1/2的去磷酸化調節(jié)有較高的特異性。有研究表明，MKP-1的過表達可以抑制

5、ET-1誘導的心肌細胞肥大反應，但是，促進MKP-1mRNA和蛋白表達增加的機制和信號轉導通路尚不清楚。因此，研究MKP-1對ERK1/2的失活作用及與E2抑制心肌細胞肥大反應的關系，對闡明E2抑制ET-1誘導的心肌細胞肥大反應機制具有重要的意義。 雖然雌激素對心血管系統(tǒng)的保護作用已經得到肯定，但是婦女絕經后，長期大量使用雌激素替代治療(estrogenreplacementtherapy，ERT)可增加子宮內膜癌的發(fā)病風險，因

6、而在一定程度上限制了它在臨床上的應用。大量的臨床試驗證實加用小量孕激素可降低子宮內膜癌的發(fā)生率，但同時可能抵消雌激素的部分心血管保護作用。雖然，孕激素單獨作用及雌孕激素聯合運用對心血管系統(tǒng)功能的影響已有一些初步的研究，但結果目前還存在爭議，而且對心肌肥大反應的影響尚未見相關報道。因此為尋找一種安全有效的臨床激素替代治療方案需要進一步深入的探討雌、孕激素對心血管系統(tǒng)的作用及其機制。 綜上所述，本課題主要利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細

7、胞，用ET-1誘導心肌細胞肥大反應，采用Bradford法、同位素法、免疫印跡法等技術，從細胞和分子水平探討E2在ET-1誘導的心肌細胞肥大反應中的作用及其細胞內信號轉導機制，并且初步探討孕激素(Progesterone，P)單獨使用以及雌孕激素聯合運用對ET-1誘導的心肌細胞肥大反應的影響，為雌激素的心血管保護作用機制提供新的基礎實驗依據，同時有助于進一步加深對性激素在心血管系統(tǒng)作用的了解，這對于臨床心肌肥厚等心血管疾病的防治具有積極

8、意義，而且也為絕經后婦女應用激素替代療法時合理聯用孕激素提供一定的實驗參考。 論文主要包括以下兩個部分： 第1章17β-雌二醇對ET-1誘導的心肌細胞肥大反應的影響及其機制 1.117β-雌二醇對ET-1誘導的心肌細胞肥大反應的影響 1.2ERK1/2信號途徑在17β-雌二醇抑制ET-1誘導的心肌肥大反應中的作用第2章孕激素單獨使用及雌孕激素聯合運用對ET-1誘導的心肌細胞肥大反應的影響 方法：1

9、、差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞，以ET-1刺激心肌細胞建立心肌肥大細胞模型； 2、以Bradford法測定心肌細胞蛋白質含量、IBAS圖像分析處理系統(tǒng)測定心肌細胞表面積、同位素法分析[3H]-亮氨酸(3H-leucine，3H-leu)摻入來作為心肌細胞肥大反應的指標； 3、以免疫印跡法檢測心肌細胞中磷酸化ERK1/2、ERK1/2總蛋白及MKP-1蛋白表達水平的變化。 結果：1、10-10～10

10、-7mol/L的ET-1作用于心肌細胞24h后顯著增加新生大鼠心肌細胞蛋白質含量、細胞表面積和3H-leu摻入，在10-10～10-7mol/L范圍內呈明顯的劑量依賴性，以10-8mol/L作用最強；10-8mol/LET-1作用于心肌細胞12h、24h、36h、48h均增加新生大鼠心肌細胞蛋白質含量和3H-leu摻入，其中以作用24h時效應最強；10-6mol/LBQ123預處理30min可抑制ET-1誘導的心肌細胞蛋白質含量的增加，

11、而BQ123單獨作用對心肌細胞蛋白質含量沒有影響。 2、10-10～10-6mol/L的E2預處理24h后可明顯抑制ET-1誘導的心肌細胞蛋白質含量、細胞表面積和3H-leu摻入的增加，其中以10-8mol/LE2作用最為明顯；預先給予10-6mol/LTamoxifen(Ta)作用30min，可部分抑制E2降低ET-1誘導的心肌細胞3H-leu摻入增加的作用，單獨給予Ta對心肌細胞3H-leu摻入沒有顯著影響；PD98059(

12、50μmol/L)預處理1h可抑制ET-1誘導的心肌細胞3H-leu摻入的增加，并且使E2對ET-1誘導的心肌細胞3H-leu摻入增加的抑制作用加強。 3、10-8mol/LET-1作用5min使心肌細胞的ERK1/2活性顯著增加，給予10-8mol/LE2預處理3h可以抑制ET-1誘導的心肌細胞ERK1/2活性增加，單獨給予E2對ERK1/2活性無明顯影響，在這一過程中心肌細胞ERK1/2總蛋白表達無明顯變化；10-6mol/

13、LTa預處理30min可逆轉E2對ET-1誘導的心肌細胞ERK1/2活性增加的抑制作用，單獨給予Ta對ERK1/2活性無明顯影響。 4、10-8mol/LET-1作用5min使心肌細胞的MKP-1蛋白表達增加；給予10-8mol/LE2預處理3h使ET-1誘導的心肌細胞MKP-1蛋白表達量進一步增加；單獨給予E2對心肌細胞MKP-1蛋白表達無明顯影響。 5、10-10～10-6mol/LP預處理24h對ET-1誘導的心肌

14、細胞3H-leu摻入、蛋白質含量的增加無顯著影響；雌孕激素聯合運用時，10-6mol/L的P對10-6、10-8mol/L的E2降低ET-1誘導的心肌細胞3H-leu摻入增加的作用具有明顯的抑制作用，這種抑制作用不存在明顯的劑量—效應相關，而當E2的濃度為10-10mol/L時，同樣10-6mol/L的P對E2的作用則未見顯著影響，E2與P的其他濃度聯合運用時，P對E2降低ET-1誘導的心肌細胞3H-leu摻入增加的作用均無明顯的抑制。

15、 結論：1、ET-1可由ETAR介導呈濃度和時間依賴性的誘導心肌細胞肥大反應；E2可抑制ET-1誘導的心肌細胞肥大反應，且這一作用至少部分是由雌激素受體介導的。 2、E2抑制ET-1誘導的心肌細胞肥大反應與ERK1/2信號途徑密切相關：E2可通過增加心肌細胞MKP-1蛋白表達，抑制ET-1誘導的心肌細胞ERK1/2活性增高，從而抑制ET-1誘導的心肌細胞肥大反應。 3、單獨使用P對ET-1誘導的心肌細胞肥大反應無