基于肝脂肪變性HepG2細(xì)胞模型探討護(hù)肝清脂片主要成分對脂質(zhì)代謝的影響及可能機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本文采用游離脂肪酸(FFA)（油酸與棕櫚酸的混合物，油酸:棕櫚酸=2∶1）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立脂肪變性細(xì)胞模型，旨在研究護(hù)肝清脂片中主要活性成分澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷葉堿對非酒精性脂肪肝脂質(zhì)代謝的影響及可能機(jī)制，以進(jìn)一步明確護(hù)肝清脂片發(fā)揮臨床療效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，給予含不同濃度的澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷葉堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，通過MT

2、T法測定細(xì)胞活性，篩選藥物的最佳作用濃度。本研究實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常組(Con)、模型組(FFA)、澤瀉醇A-24-醋酸酯組(FA)、熊果酸組(FU)、荷葉堿組(FN)、非諾貝特組(FF)。正常組HepG2細(xì)胞用含1％ BSA的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，模型組HepG2細(xì)胞用1mMFFA處理24h，藥物組HepG2細(xì)胞分別用含終濃度為10μM的澤瀉醇A-24-醋酸酯、80μM熊果酸、50μM荷葉堿、10μM非諾貝特和終濃度為1mM FFA培養(yǎng)液一起

3、孵育24h。采用油紅O染色法觀察不同組別細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，并測定其脂質(zhì)含量。同時(shí)采用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量;酶聯(lián)免疫吸附法(Elisα)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6和Adiponectin的含量。RT-PCR測定Adiponectin mRNA、AMPK mRNA、SREBP-1c mRNA、ACC mRNA和PPARα mRNA的表達(dá)情況;Western blot測定p-AMPKα、SREBP-1、p-ACC

4、和PPARα的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷葉堿的濃度與HepG2細(xì)胞的活性呈劑量依賴關(guān)系。HepG2細(xì)胞被藥物孵育24h后，隨著藥物濃度的增大細(xì)胞活性降低。當(dāng)澤瀉醇A-24-醋酸酯為10μM，熊果酸為80μM，荷葉堿為50μM時(shí)，各自的存活率分別為91.5％、89.5％和87.2％。
　　2.油紅O染色結(jié)果顯示模型組細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重肝脂肪變性，存在大量紅色脂滴，澤瀉醇A-24-醋酸

5、酯、熊果酸、荷葉堿和非諾貝特組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)目明顯減少。模型組脂質(zhì)含量明顯高于正常組(p＜0.01)，澤瀉醇A-24-醋酸酯、荷葉堿和非諾貝特能顯著降低肝脂肪變性HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量(p＜0.05或p＜0.01)，熊果酸能降低脂質(zhì)含量但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，模型組細(xì)胞內(nèi)TG含量也明顯高于正常組(p＜0.01)，澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷葉堿和非諾貝特均能顯著降低肝脂肪變性HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量（p值均為0.01）。

6、　　3.Elisa結(jié)果顯示模型組炎癥因子TNF-α和IL-6的水平顯著增加(p＜0.01)，澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷葉堿均能逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞的TNF-α和IL-6水平的增加（p值均小于0.01）。而非諾貝特不能顯著降低肝脂肪變性HepG2細(xì)胞的TNF-α和IL-6的水平(p＞0.05)。
　　4.與正常組相比，模型組中Adiponectin mRNA和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Adiponectin分泌蛋白的表達(dá)量均顯

7、著降低(p＜0.01)，澤瀉醇A-24-醋酸酯和非諾貝特在mRNA和分泌蛋白水平上均能顯著上調(diào)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞Adiponectin的表達(dá)(p＜0.01，p＜0.05);熊果酸和荷葉堿在mRNA水平上未能上調(diào)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞Adiponectin的表達(dá)(p＞0.05)，但在分泌蛋白水平上可上調(diào)其表達(dá)(p＜0.05，p＜0.01)。
　　5.與正常組相比，模型組中AMPK mRNA的表達(dá)顯著減少，ACC mRNA和S

8、REBP-1cmRNA的表達(dá)顯著增多(p＜0.01);澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷葉堿能顯著下調(diào)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞ACC mRNA和SREBP-1 c mRNA的表達(dá)，上調(diào)AMPK mRNA的表達(dá)(p＜0.05，p＜0.01);非諾貝特只下調(diào)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞ACC mRNA和SREBP-1c mRNA的表達(dá)，未表現(xiàn)出對AMPKmRNA表達(dá)的上調(diào)作用。在蛋白水平上，與正常組相比，模型組中p-AMPKα的表達(dá)水平顯著降低

9、(p＜0.01)，而p-ACC和SREBP-1的表達(dá)水平則顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷葉堿和非諾貝特均能顯著升高肝脂肪變性HepG2細(xì)胞p-AMPKα的表達(dá)水平(p＜0.01)，降低p-ACC和SREBP-1的表達(dá)水平(p＜0.05，p＜0.01)。
　　6.與正常組相比，模型組中PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著降低(p＜0.01);熊果酸、荷葉堿和非諾貝特均能顯著升高肝脂肪變

10、性HepG2細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)水平(p＜0.01)，而澤瀉醇A-24-醋酸酯對PPARα的表達(dá)無影響(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.10μM澤瀉醇A-24-醋酸酯，80μM熊果酸，50μM荷葉堿對細(xì)胞活力影響均在90％左右，為最佳作用濃度。
　　2.澤瀉醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷葉堿均能明顯減少脂肪變性HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)堆積，并抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生;非諾貝特能明顯減少脂肪變性He

11、pG2細(xì)胞的脂質(zhì)堆積，但未表現(xiàn)出抑制TNF-α和IL-6產(chǎn)生的作用。護(hù)肝清脂片所含三種活性成分中，以澤瀉醇A-24-醋酸酯的效果最好。
　　3.澤瀉醇A-24-醋酸酯能上調(diào)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞Adiponectin的表達(dá)，并能上調(diào)AMPK的表達(dá)，及下調(diào)SREBP-1c和ACC的表達(dá)，熊果酸、荷葉堿和非諾貝特能上調(diào)肝脂肪變性HepG2細(xì)胞Adiponectin的表達(dá)，并能同時(shí)上調(diào)AMPK和PPARα的表達(dá)，及下調(diào)SREBP-1c