CD133及CD166在腦膜瘤中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、背景：
　　 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過程，涉及到外界因素的刺激、癌基因的激活、抑癌基因的失活等一系列的過程。但人們?cè)谘芯看竽c癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，腸道上皮細(xì)胞存活期短，沒有足夠的時(shí)間積累基因突變引起腫瘤，因此研究人員把目光投入到能夠長(zhǎng)期存在未分化的干細(xì)胞而不是已分化的腫瘤細(xì)胞。1997年Bonnet等[1]分離出人急性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅占0.2％的具有CD34+CD38-表型的腫瘤細(xì)胞能夠使NOD/SCID小鼠體內(nèi)形

2、成瘤，而其它表型的大部分細(xì)胞無(wú)法形成腫瘤。2001年Reya等[2]首次提出了腫瘤干細(xì)胞(TSC)學(xué)說(shuō)，認(rèn)為腫瘤組織中存在少量具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞，它在腫瘤組織中所占比例雖然很少，卻與腫瘤起源、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗關(guān)系密切[3-5]，而其它大部分腫瘤細(xì)胞經(jīng)過幾代短暫的分化后最終死亡。隨后陸續(xù)在大腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等各種實(shí)體腫瘤中培養(yǎng)出腫瘤干細(xì)胞，并對(duì)其細(xì)胞標(biāo)記物、生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　

3、 現(xiàn)在比較公認(rèn)的腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)表面標(biāo)記物是細(xì)胞表面粘附分子CD133[6]。Singh等[7]培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞球，接種100個(gè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞使NOD/SCID小鼠致瘤，所形成的腫瘤與原腫瘤表型一致。但隨著腫瘤干細(xì)胞研究的進(jìn)展，研究人員發(fā)現(xiàn)CD133作為腫瘤干細(xì)胞具有一定局限性。Myung和Woolard等[8]研究發(fā)現(xiàn)大約40％新鮮分離的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本并不表達(dá)CD133陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞;Wang等[9]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中存在部分

4、CD133陰性的腫瘤細(xì)胞仍具有致瘤性，在此研究中發(fā)現(xiàn)CD133陰性細(xì)胞具有分化為CD133陽(yáng)性細(xì)胞的能力，因此認(rèn)為此類CD133陰性細(xì)胞也為腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)。2011年Rath，P等培養(yǎng)鑒定出腦膜瘤干細(xì)胞，并對(duì)其表面標(biāo)記物進(jìn)行了研究，認(rèn)為CD133并非僅有的腦腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，CD166也是一種有價(jià)值的干細(xì)胞標(biāo)記物。
　　 腦膜瘤是一種常見的顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的20％[11]，以手術(shù)治療為主，90％腦膜瘤為WHO

5、Ⅰ級(jí)，WHOⅡ腦膜瘤約占4.6％-7.2％，WHOⅢ腦膜瘤約占1％-3％[12]。腦膜瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵。腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133及CD166為抗腫瘤治療提供了新思路和可能的治療靶點(diǎn)。前期大量的文獻(xiàn)證實(shí)，CD133和CD166表達(dá)水平和多種腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤預(yù)后相關(guān)因素之一。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦膜瘤組織中干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD166的表達(dá)，探討腫瘤組織中CD133和CD166陽(yáng)性細(xì)胞分布情況

6、和臨床意義，以及CD166作為腦膜瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物的可行性。
　　 目的：
　　 本研究采用免疫組化學(xué)技術(shù)，對(duì)比觀察CD133與CD166在不同級(jí)別腦膜瘤中的表達(dá)，探討兩者相關(guān)性及臨床意義，為腦膜瘤診斷、治療尋找更好的靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)過程：
　　 1.材料和方法
　　 1.1 臨床資料80例腦膜瘤樣本來(lái)源于珠江醫(yī)院病理科2006年至2009年保存的石蠟標(biāo)本。均經(jīng)病理學(xué)專家確診，按照WHO(200

7、7)腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類、分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)腦膜瘤33例;Ⅱ級(jí)44例，其中非典型腦膜33例，其它11例;Ⅲ級(jí)3例，均為間變性腦瘤。按級(jí)別分為兩組，Ⅰ級(jí)腦膜瘤為低級(jí)別，Ⅱ-Ⅲ級(jí)腦膜瘤為高級(jí)別。
　　 1.2 試劑及免疫組化方法 CD166兔抗人多克隆抗體（北京博奧森公司），CD133兔抗人多克隆抗體（北京中杉金橋公司），及免疫組化試劑盒(Biogenex公司)。標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片的厚度為5um，脫蠟水化，修

8、復(fù)抗原。操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。每批染色以結(jié)腸癌標(biāo)本作為CD133和CD166的陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液代替一抗體作為陰性對(duì)照。
　　 1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)CD133及CD166陽(yáng)性表達(dá)為定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色且高出背景色。腫瘤組織的整體陽(yáng)性表達(dá)程度用棕黃色物質(zhì)的積分光密度(IOD)值表示。圖像定量分析的過程:高倍鏡(400×)下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，使用Image-Pro Plus6.0病理圖像分析軟件計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞IOD

9、值。
　　 2.實(shí)驗(yàn)步驟
　　 石蠟切片經(jīng)過脫蠟和水化后，對(duì)組織進(jìn)行高壓鍋熱修復(fù)。自然狀態(tài)下冷卻，蒸餾水沖洗2次，每次5min，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate bufferedsaline，PBS)浸泡3次，每次5 min。使用吸水紙吸除殘留載玻片PBS緩沖液后，加入3％過氧化物阻斷劑(Hydrogen Peroxide Block)50-100μl，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10min。

10、PBS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，滴加強(qiáng)力阻斷劑5％牛血清，室溫孵育10min;用力輕甩去非免疫性牛血清封閉液，滴加一抗CD133或CD166（用PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照），放置于4℃冰箱過夜處理;PBS液中沖洗5min×3次;使用吸水紙吸除殘留載玻片上PBS緩沖液，滴加Super Enhancer液工作液，室溫孵育15-20min;在PBS液中沖洗3min×3次;滴加Polymer HRP試劑，室溫孵育30min; P

11、BS液中沖洗3min×3次;甩去PBS液，每張片滴加2滴新配制的DAB溶液（按說(shuō)明書配制）;3min后顯微鏡下觀察顯色情況，充分顯色后終止反應(yīng)，流動(dòng)自來(lái)水充分沖洗15min;蘇木素復(fù)染1min，酒精分化2秒鐘，流動(dòng)自來(lái)水中沖洗10min以上，使用吹風(fēng)機(jī)吹干;放入二甲苯透明，中性樹膠封片。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用中位數(shù)(Median，M)表示。根

12、據(jù)數(shù)據(jù)類型，性別、年齡、高低級(jí)別組腦膜瘤中CD133/CD166的IOD值比較采用兩獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，部位間采用多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。CD133與CD66的IOD值之間的相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、CD133/CD166在腦膜瘤中的表達(dá)及分布形態(tài)多樣，基本形態(tài)主要如下:CD133陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)有點(diǎn)狀陽(yáng)性、

13、簇狀聚集陽(yáng)性、血管周圍存在陽(yáng)性;CD166陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)有散在點(diǎn)狀陽(yáng)性、簇狀聚集陽(yáng)性;兩種抗體均表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。
　　 2、CD133/CD166陽(yáng)性表達(dá)在不同級(jí)別腦膜瘤組織的分布特征如下:CD133與CD166在不同級(jí)別的腦膜瘤均有表達(dá);且CD133陽(yáng)性細(xì)胞與CD166陽(yáng)性細(xì)胞的分布有一定規(guī)律性，CD133及CD166陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平隨腦膜瘤病理分級(jí)增高而增高，低級(jí)別組CD133及CD166陽(yáng)性細(xì)胞較少，多散在分布，高級(jí)別

14、組CD133及CD166陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)較多，更多標(biāo)本中能夠觀察到陽(yáng)性聚集分布，可見分布于血管壁的周圍，在CD133染色中，可見CD133陽(yáng)性血管，這些CD133陽(yáng)性細(xì)胞考慮為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，CD166染色為陰性。
　　 3、不同級(jí)別組腦膜瘤中CD133陽(yáng)性細(xì)胞與CD166陽(yáng)性細(xì)胞IOD值;在不同級(jí)別組腦膜瘤中CD133陽(yáng)性細(xì)胞IOD值分別為2466.59（高級(jí)別組）及578.56（低級(jí)別組），秩和檢驗(yàn)兩組存在顯著性差異(Z=-4

15、.080，P=0.000);在不同級(jí)別組腦膜瘤中CD166陽(yáng)性細(xì)胞IOD值分別為12919.51（高級(jí)別組）及4678.79（低級(jí)別組），秩和檢驗(yàn)兩組存在顯著性差異(Z=-4.657，P=0.000)。
　　 4、CD133與CD166表達(dá)的相關(guān)性及共定位表達(dá)情況，隨CD133表達(dá)升高CD166表達(dá)也有逐漸增高的趨勢(shì)。Spearman直線相關(guān)性檢驗(yàn)顯示CD133與CD166在腦膜瘤組織中IOD值呈顯著正相關(guān)(R=0.706，P=

16、0.000)。鏡下觀察連續(xù)切片組織，可發(fā)現(xiàn)在相同區(qū)域的兩種抗體存在共定位表達(dá)的現(xiàn)象，周圍組織呈陰性表達(dá)，可作為內(nèi)對(duì)照區(qū)。
　　 5、CD133、CD166與腦膜瘤預(yù)后的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)高低級(jí)別組腦膜瘤的3年內(nèi)復(fù)發(fā)率，CD133弱表達(dá)組復(fù)發(fā)率為15.38％，強(qiáng)表達(dá)組復(fù)發(fā)率為28.57％，卡方檢驗(yàn)二者無(wú)顯著性差異(p=0.16)，提示CD133的表達(dá)量與腦膜瘤復(fù)發(fā)無(wú)明顯相關(guān)性。CD166弱表達(dá)組復(fù)發(fā)率為10.86％，強(qiáng)表達(dá)組復(fù)發(fā)率為32.

17、35％，二者存在顯著性差異(P=0.018)。CD166高表達(dá)組的復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)組。
　　 結(jié)論：
　　 1、CD133與CD166在不同級(jí)別的腦膜瘤均有表達(dá)，CD133及CD166陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平隨腦膜瘤病理級(jí)別增高而增高。并且在不同級(jí)別組腦膜瘤中CD133陽(yáng)性細(xì)胞(p=0.001)與CD166陽(yáng)性細(xì)胞(p=0.000) IOD值差異均有顯著性。
　　 2、CD133及CD166表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系。經(jīng)Spear