蠕形螨全蛋白提取及相對(duì)分子量鑒定.pdf

1、人體蠕形螨，屬節(jié)肢動(dòng)物門，蠕形螨科，俗稱毛囊蟲(follicle mites)，分為毛囊蠕形螨(Demodex folliculorum)和皮脂蠕形螨(Demodex brevis)兩種，分別寄生于人體毛囊和皮脂腺內(nèi)?？梢鹑梭w蠕形螨病，表現(xiàn)為皮膚粗糙、毛孔擴(kuò)張、毛囊炎、皮脂腺囊腫、脫發(fā)等癥狀。最早在哺乳期，嬰兒即可從母體感染蠕形螨。世界各地均有蠕形螨病病例報(bào)道，蠕形螨病主要通過接觸傳播，呈世界性分布。近十幾年蠕形螨病的研究受到關(guān)注，逐

2、漸成為人體寄生蟲學(xué)及皮膚病學(xué)領(lǐng)域的熱門課題。從目前參考文獻(xiàn)看，對(duì)人體蠕形螨的研究不多，主要集中在形態(tài)學(xué)和臨床治療方面，國(guó)內(nèi)對(duì)蠕形螨的研究在數(shù)量、深度和廣度方面均已超過國(guó)外，但有關(guān)人體蠕形螨病的研究仍處于起步階段。因觀察到蠕形螨的諸多體表銳性結(jié)構(gòu)，蠕形螨機(jī)械致病學(xué)說得到公認(rèn)，但對(duì)其化學(xué)致病和免疫致病機(jī)制仍不清楚。臨床醫(yī)生對(duì)蠕形螨病尚停留在對(duì)癥治療階段。蠕形螨分子生物學(xué)研究剛剛起步，有報(bào)道已成功提取到了蠕形螨RNA、DNA，建立了其cDNA

3、文庫(kù)，但對(duì)蠕形螨基因功能和基因表達(dá)的研究還處于空白階段。蠕形螨分子生物學(xué)研究滯后的主要原因是，蠕形螨形體微小，需要用專門的工具和技術(shù)收集處理標(biāo)本，缺乏成熟的提取蠕形螨基因和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也成為阻礙研究進(jìn)展的技術(shù)瓶頸。我們研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)多年的努力成功解決了上述技術(shù)難題。另外人體蠕形螨實(shí)驗(yàn)標(biāo)本局限于從志愿者身上獲取，不能人工培養(yǎng)，我們課題組用分子遺傳學(xué)方法證明山羊蠕形螨與皮脂蠕形螨之間的遺傳距離較毛囊蠕形螨與皮脂蠕形螨之間的遺傳距離更近，理論

4、上山羊蠕形螨是研究?jī)煞N人體蠕形螨的理想動(dòng)物模型。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)主要實(shí)施者，通過解讀蛋白質(zhì)來研究生物的特征，掀開了生命科學(xué)研究的新篇章。從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度出發(fā)，了解蠕形螨的生理代謝和致病機(jī)理是一種全新而根本的途徑。
　　目的：蠕形螨蛋白質(zhì)方面的研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)試圖探索蠕形螨全蛋白的提取方法，并初步分離、鑒定和分析蠕形螨蛋白質(zhì)組分。為進(jìn)一步從蛋白組學(xué)的角度探索蠕形螨蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和致病性做基礎(chǔ)鋪墊。為建立蠕形螨蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)

5、增添重要信息。
　　方法：從波爾山羊的新鮮皮膚結(jié)節(jié)中收集山羊蠕形螨樣本。準(zhǔn)備消毒實(shí)驗(yàn)器具，制備試液。在剝離面用手術(shù)刀切開羊皮結(jié)節(jié)，將其內(nèi)干酪樣物（0.5g)轉(zhuǎn)移至特制的微型水晶研缽內(nèi)，加入相同體積的洗潔精原液，用自制研磨棒將混合物充分研磨至均勻乳液狀，再將其轉(zhuǎn)移到15 ml玻璃試管中，加入8 ml PBS進(jìn)行稀釋，用玻璃材質(zhì)皮試注射器吹打混勻。20℃，自然沉淀1h，吸除上清液，重復(fù)上述步驟3次。再將清洗沉淀物轉(zhuǎn)移至1.5 ml E

6、P管中，8，000 rpm離心20 min，棄上清液即得實(shí)驗(yàn)樣本。稱重等分樣本，分裝于EP管中，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。分別用液氮研磨法和機(jī)械勻漿法破碎蠕形螨樣本，每種又分別使用RIPA裂解液和自制裂解液裂解，得到四種裂解樣本。13，000 rpm離心60 min，取上清液，置于EP管中，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。用非干擾型蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，檢測(cè)提取蠕形螨蛋白的濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析比較提取蠕形

7、螨蛋白的效果。用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定部分蛋白質(zhì)條帶。根據(jù)Mascot檢索軟件檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)山羊蠕形螨蛋白組分進(jìn)行初步分析。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功提取了山羊蠕形螨全蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，液氮研磨法破碎螨體的效果較機(jī)械勻漿法好。用自制裂解液裂解蠕形螨組織細(xì)胞的效果較傳統(tǒng)的RIPA裂解液效果好，前者裂解出的蠕形螨蛋白濃度高，提取到的蛋白質(zhì)較全，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白可見蛋白條帶多且清晰。

8、用液氮研磨法加自制裂解液裂解樣本，提取螨形螨蛋白效果最佳。MALDI-TOF-MS鑒定部分蛋白條帶，檢索蛛形綱蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)出了21種可信蛋白，170 kD的蛋白為胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白，130 kD的蛋白為腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺連接酶，15 kD以下蛋白大部分為組蛋白。70 kD和15 kD蛋白與相近物種蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)沒有對(duì)應(yīng)的可信蛋白，本實(shí)驗(yàn)是首次提取蠕形螨蛋白，沒有蠕形螨蛋白質(zhì)專有數(shù)據(jù)庫(kù)，因此分子量位于70 kD和15 kD的蛋白也可能是蠕