紅麻CMS的轉(zhuǎn)錄組比較分析及SF3基因的功能研究.pdf

1、細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)廣泛存在于植物界，是作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。對CMS發(fā)生的分子機制的研究能為人工不育系的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)，因此，探索、發(fā)掘與CMS相關(guān)的基因功能具有重要意義。本研究通過對紅麻不育系和保持系花藥RNA進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，并進行生物信息學分析，構(gòu)建紅麻花藥發(fā)育的基因表達譜，研究紅麻花藥發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)DGE(Differential GeneExpr

2、ession)分析結(jié)果并結(jié)合RT-PCR篩選，最終選定花粉特異蛋白SF3(Pollen specificprotein SF3)基因作為研究對象，對其克隆，表達模式分析并構(gòu)建載體進行轉(zhuǎn)基因功能研究，主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過轉(zhuǎn)錄組測序分析最終得到54563個基因Unigenes，其中有45930(84％)的序列與蛋白數(shù)據(jù)庫相對應(yīng)，15977(29％)的序列與286個KEGG途徑有關(guān)，20289(37％)個屬于直系同源基因家族

3、大類，38611(71％)個基因都至少有一個GO，它們分為50個功能基因組，通過數(shù)字基因表達譜(DGE)的方法，在對比不育系與保持系中檢測發(fā)現(xiàn)有4584個基因至少有2倍以上的差異;充分分析這些差異表達基因的GO條目和KEGG途徑發(fā)現(xiàn)，這些差異基因可分為155個GO條目，主要存在于74個KEGG途徑中，其中有67個轉(zhuǎn)錄本只存在于不育系基因組，78個轉(zhuǎn)錄本只存在于保持系。
　　2.采用同源克隆的方法，將SF3基因測序拼接的序列結(jié)果與高

4、通量轉(zhuǎn)錄組測序序列相比對，選取同源性較高的基因序列。用ORF finder尋找其最長的開放閱讀框，在開放閱讀框序列收尾的起始密碼子和終止密碼子前后設(shè)計引物擴增該基因全長，通過比對找到SF3基因的全長。
　　3.在差異基因中選用紅麻花粉特異蛋白SF3基因作為主要研究對象，通過RT-PCR技術(shù)，基因克隆獲得SF3基因在紅麻P3A、P3B不同時期花藥和根的表達情況，發(fā)現(xiàn)在同一品種間單核期與雙核期SF3基因的表達量有明顯的差異，這與已知的

5、研究結(jié)果SF3基因在花粉的發(fā)育中是累積的一致;同一時期不育系和保持系中，不育系SF3的表達量低于保持系，但是在根中兩系中并無明顯差別，這或許能說明該基因在P3A和P3B中表達量具有時空特異性。
　　4.根據(jù)SF3基因全長序列設(shè)計載體，選用其特異序列為干擾區(qū)，構(gòu)建SF3 RNAi干擾載體和正義表達載體，為進一步研究該基因在紅麻發(fā)育中的功能奠定理論基礎(chǔ)。由于該基因與煙草相比其同源性大于(75％)，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)煙草方法將RNA