紅麻UG93A和UG93B線粒體基因組差異分析及CMS相關(guān)基因的發(fā)掘.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)系是雜交種子生產(chǎn)的基礎(chǔ)，也是研究核質(zhì)互作關(guān)系的良好材料，其分子機(jī)理研究長(zhǎng)期以來(lái)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　紅麻(Hibiscus cannabinusL.)是一年生韌皮纖維植物，是重要的麻紡和造紙?jiān)?。因其以收獲莖稈和韌皮纖維為主要生產(chǎn)目的，紅麻易獲得營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，其雜種優(yōu)勢(shì)利用對(duì)紅麻育種家具有極大的誘惑力。廣西大學(xué)周瑞陽(yáng)教授的創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)于200

2、1年3月在海南冬繁的紅麻野生種UG93中發(fā)現(xiàn)了1株雄性不育株，以此為細(xì)胞質(zhì)供體，已選育出7個(gè)紅麻CMS系，組配出了4個(gè)紅優(yōu)系列三系雜交種，我國(guó)紅麻雜種優(yōu)勢(shì)的利用居國(guó)際領(lǐng)先水平。
　　研究發(fā)現(xiàn)，紅麻UG93群體中大部分可育株系可以保持UG93雄性不育株的CMS特性，以此可育株系為細(xì)胞核供體，已選育出了UG93A及其保持系UG93B（UG93中具有保持CMS特性的可育株系）。由于二者源于同一品種群體，推測(cè)UG93A是UG93B的CMS

3、突變型，UG93B是其野生型。因其為細(xì)胞質(zhì)近等基因系，為研究紅麻CMS的分子機(jī)理提供了及有價(jià)值的研究材料。
　　本研究以紅麻CMS系UG93A，保持系UG93B和UG93A/992（恢復(fù)系）雜交F1為材料，通過高通量測(cè)序、Northern Blot等方法從基因組水平和RNA表水平研究了紅麻不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的線粒體基因組結(jié)構(gòu)差異和轉(zhuǎn)錄本差異，得到以下主要結(jié)論:
　　1.利用SMRT測(cè)序技術(shù)對(duì)紅麻UG93B線粒體全基因組進(jìn)行高

4、通量測(cè)序，將原始數(shù)據(jù)過濾和接頭去除后，得到67，152條reads，平均長(zhǎng)度為5.4k，最長(zhǎng)的read達(dá)到32kb，測(cè)序深度達(dá)605×。以長(zhǎng)的reads做為種子序列，將短序列比對(duì)到長(zhǎng)的種子序列，以提高長(zhǎng)序列堿基的準(zhǔn)確度，得到高質(zhì)量的長(zhǎng)reads12.1Mb，平均長(zhǎng)度為6.7kb，質(zhì)量值高達(dá)Q59。
　　2.將過濾后紅麻線粒體測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到紅麻線粒體全基因組是一個(gè)序列長(zhǎng)度為569，912bp，GC含量為44.9％的環(huán)狀DNA

5、分子，并繪制了紅麻線粒體完成圖譜。通過注釋軟件對(duì)紅麻線粒體基因進(jìn)行注釋，得出紅麻線粒體基因組中共有59個(gè)線粒體基因，其中包括36個(gè)是蛋白編碼基因，3個(gè)rRNA基因和20種tRNA基因，這些線粒體序列占總線粒體基因組序列的7.1％，同時(shí)預(yù)測(cè)到375個(gè)序列長(zhǎng)度大于100bp的orfs，這一部分序列占紅麻線總粒體基因組的26％。
　　3.紅麻UG93B線粒體基因組中總共有50個(gè)大小從65-7782bp的重復(fù)序列，占總線粒體基因組序列的3

6、.4％。這些重復(fù)序列主要以大于100bp重復(fù)的序列為主，共有28個(gè)，而大于1kb以上的重復(fù)序列只有3個(gè)。在這些大片段(＞=100bp)的重復(fù)序列中，除了有3個(gè)重復(fù)片段有3個(gè)拷貝以外，其他的絕大多數(shù)以兩個(gè)拷貝為主，紅麻UG93B基因組中，重復(fù)序列以正向重復(fù)和回文重復(fù)為主。
　　4.將紅麻UG93A線粒體基因組重測(cè)序序列與參考序列UG93B線粒體基因組比對(duì)，共找到398個(gè)SNPs和230個(gè)InDels變異位點(diǎn)，其中有362個(gè)SNPs分

7、布在基因間或內(nèi)含子上，占總SNPs變異位點(diǎn)的90％，只有36個(gè)SNPs分布在線粒體基因的編碼區(qū)，占總SNPs的10％。其中有15個(gè)SNPs在基因編碼區(qū)發(fā)生同義突變，導(dǎo)致6個(gè)線粒體基因的氨基殘基組成發(fā)生變化。在230個(gè)InDels變異位點(diǎn)中，以小片段的InDels為主(1-5bp)，占InDel總數(shù)的77.4％。而6-31bp的InDe只占總InDel的22.6％。而且絕大多數(shù)的InDels位點(diǎn)分布在基因間隔區(qū)間和內(nèi)含子區(qū)，僅有11個(gè)In

8、Dels(占4.8％)分布在基因的編碼區(qū)。
　　5.利用Northern B1ot技術(shù)檢測(cè)了36個(gè)紅麻蛋白編碼的線粒體基因在UG93A、UG93B和F1(UG93A/992)之間mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異，其中只有6個(gè)線粒體基因的轉(zhuǎn)錄本在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)之間存在差異，它們分別是atp1、atp4、atp6、atp9、cox3和sdh4，其中，除了atp9以外，其他5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本雖然在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)之間有差異，但F1(UG93A

9、/992)的轉(zhuǎn)錄本與UG93A的轉(zhuǎn)錄本完全相同，說(shuō)明這幾個(gè)線粒體基因與紅麻CMS沒有直接的關(guān)系。
　　6.在atp9的轉(zhuǎn)錄本中，UG93A的轉(zhuǎn)錄本小于UG93B和F1(P3A/992)代，雖然UG93A和F1(P3A/992)胞質(zhì)相同，由于F1(UG93A/992)中有核恢復(fù)基因，影響了atp9在F1(UG93A/992)的表達(dá)，進(jìn)一步推測(cè)atp9有可能與紅麻CMS有著密切的關(guān)系。
　　7.紅麻atp8基因長(zhǎng)度為480bp，

10、編碼159個(gè)氨基酸殘基，而且在其3'側(cè)翼序列中不育系UG93A比UG93B多9bp插入，用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)比較兩個(gè)材料之間RNA編輯的差異，結(jié)果表明，在UG93A中，atp8基因有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了RNA編輯，而UG93B中存在6個(gè)RNA編輯位點(diǎn)，而且不育系中RNA編輯頻率高于保持系。在不育系、保持系和F1(UG93A/992)之間對(duì)atp8進(jìn)行相對(duì)熒光定量表達(dá)差異分析，得出atp8在UG93A中相對(duì)表達(dá)量顯著低于UG93B和F