血清microRNA作為食管鱗狀細(xì)胞癌診斷及手術(shù)療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究.pdf

1、食管癌(esophageal cancer，EC)是一種發(fā)病率占全球癌癥第八位、致死率占第六位的消化道惡性腫瘤，其男性發(fā)病率高于女性。EC主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamouscell carcinoma，ESCC)、食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和未分化癌，我國(guó)是ESCC發(fā)病率最高的國(guó)家之一。食管癌的早期癥狀不明顯，確診時(shí)大多已屬中晚期。由于ESCC患者的預(yù)后影響因素復(fù)雜

2、，很難對(duì)其進(jìn)行有效的預(yù)后判斷來提高患者生存率。目前，淋巴結(jié)非轉(zhuǎn)移患者術(shù)后五年的生存率為20％～30％，而轉(zhuǎn)移患者術(shù)后五年的生存率僅為13％，因此尋找有效的ESCC診斷、手術(shù)療效評(píng)估和預(yù)后標(biāo)志物迫在屑睫。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)約19～24個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性單鏈小分子RNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶mRNA序列的3'端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)完全或部分結(jié)合，從

3、而抑制靶基因的表達(dá)或促使其降解。一些miRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平差異顯著，具有腫瘤組織特異性。在對(duì)前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和食管癌等癌癥的早期研究中發(fā)現(xiàn)，患者血清中miRNA表達(dá)譜呈現(xiàn)出特異性變化，提示血清miRNA可作為一種潛在的新型標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷或預(yù)后評(píng)估。因此，我們推測(cè)ESCC患者血清中存在的特異miRNA，有望成為ESCC患者診斷、手術(shù)療效或預(yù)后評(píng)估的有效標(biāo)志物。
　　目的:篩選ESCC患者血清中顯

4、著升高而在術(shù)后則明顯降低的血清miRNA，評(píng)價(jià)其對(duì)ESCC患者的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:收集未經(jīng)任何治療的63例ESCC患者術(shù)前血清樣本和對(duì)應(yīng)的術(shù)后1～2周的血清樣本，同時(shí)以其中26例患者術(shù)后兩周以后的血清樣本作為預(yù)后研究對(duì)象，以63例年齡、性別匹配的正常人血清作對(duì)照。首先運(yùn)用低密度芯片技術(shù)對(duì)28例ESCC患者和28例正常人組成的兩份混合血清中768種miRNA的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，篩選出與正常人相比在ESCC患者血清中表達(dá)上調(diào)的血

5、清miRNA。其次，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitive real-time PCR，qRT-PCR)對(duì)部分低密度芯片初篩的miRNA及部分ESCC組織或癌細(xì)胞中表達(dá)異常的消化系統(tǒng)腫瘤相關(guān)miRNA在復(fù)篩組（18例ESCC患者術(shù)前術(shù)后血清和18例正常血清）中逐一測(cè)定，篩選出在患者血清巾顯著升高的miRNA。然后運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)在驗(yàn)證組(45例ESCC患者術(shù)前術(shù)后血清和45例正常血清)中驗(yàn)證，篩選復(fù)篩組和驗(yàn)證組中與預(yù)后相

6、關(guān)的miRNA，用以評(píng)估其對(duì)ESCC患者的手術(shù)療效。最后對(duì)26例患者術(shù)后兩周以后進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，根據(jù)病人回訪生存情況及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)其在預(yù)測(cè)患者生存狀況方面的價(jià)值。
　　結(jié)果:低密度芯片結(jié)果顯示，ESCC患者血清miRNA表達(dá)譜與正常人具有顯著差異，其中21種miRNA在患者血清中的表達(dá)明顯上調(diào)（2倍以上），從中選取4種miRNA(Ct＜25)及ESCC組織或癌細(xì)胞中表達(dá)異常的消化系統(tǒng)腫瘤相關(guān)的7種miRNA（包括miRNA-7、2

7、5、31、100、141、1247、193a-3p、194、223、337-5p及483-5p）用qRT-PCR技術(shù)在復(fù)篩組中驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中9種miRNA(miR-25、31、100、193a-3p、223、194、141、337-5p和miR-483-53p)在患者術(shù)前血清中的表達(dá)量較正常人顯著上升（變化倍數(shù)為1.57～6.42倍，P＜0.05）;驗(yàn)證組中9種miRNA在ESCC患者術(shù)前血清中依然顯著升高(變化倍數(shù)為1.47～8.09

8、倍，P＜0.05)。其中有5種miRNA（miR-141、193a-3p、194、223及337-5p）在患者術(shù)后較術(shù)前顯著降低。9種術(shù)前較正常對(duì)照顯著升高的miRNA的ROC曲線下面積分別為miR-25(AUC=0.845,95％CI=0.775～0.914), miR-31(AUC=0.748,95％CI=0.663～0.833),miR-100(AUC=0.785,95％CI=0.705～0.866), miR-141(AUC=0

9、.716,95％CI=0.626～0.806),miR-193a-3p(AUC=0.861,95％CI=0.796～0.927),miR-194(AUC=0.827,95％CI=0.755～0.899),miR-223(AUC=0.778,95％CI=0.699～0.857),miR-337-5p(AUC=0.878,95％CI=0.812～0.943), miR-483-5p(AUC=0.84,95％CI=0.79～0.89)。9種m

10、iRNA的AUC明顯高于CEA(AUC=0.578，95％CI=0.473～0.682)。根據(jù)選定的cut off值，9種血清miRNA對(duì)ESCC診斷的靈敏性和特異性分別是:miR-25為71％和86％，miR-31為62％和81％，miR-100為68％和81％，miR-141為50％和86％，miR-193a-3p為75％和89％，miR-194為62％和90％，miR-223為65％和79％，miR-337-5p為78％和91％，

11、miR-483-5p為75％和82％。在對(duì)其中26例患者術(shù)后兩周以后樣本的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，miR-141、194在死亡患者術(shù)后1～2周血清中明顯降低，但在術(shù)后兩周以后樣本中均有升高的趨勢(shì);miR-223的含量變化與患者病情及生存狀況呈顯著相關(guān)。單因素相關(guān)性分析顯示，miR-141、337-5p與ESCC病理分型呈顯著正相關(guān)，miR-141、223、100與ESCC的TNM分級(jí)呈顯著正相關(guān)，因此，這幾種miRNA可能在ESCC的發(fā)生、發(fā)展

12、過程中起重要作用。
　　結(jié)論:ESCC患者術(shù)前血清樣本中9種miRNA(miR-25、31、100、141、193a-3p、194、223、337-5p和miR-483-5p)與正常人相比顯著升高，具潛在的ESCC早期診斷價(jià)值;其中5種miRNA（miR-141、223、337-5p、194和miR-193a-3p）在患者術(shù)后樣本中顯著降低，具評(píng)價(jià)手術(shù)效果潛能;而miR-194、141在死亡ESCC患者術(shù)后1～2周時(shí)降低，而在術(shù)后