遠程缺血預(yù)處理提高梗死后心肌募集移植干細胞能力的實驗研究.pdf

1、背景：細胞移植已成為一種治療缺血性心臟病的方法。靜脈途徑輸注干細胞是一種無創(chuàng)、可重復(fù)、有前途的移植途徑，并在臨床中初步得到應(yīng)用。由于肺循環(huán)的截留，心臟內(nèi)細胞存留比例低嚴重影響治療效果。急性心梗后，梗死心肌的基質(zhì)細胞衍化因子-l表達上調(diào)誘導(dǎo)干細胞定向遷移到損傷區(qū)。但其誘導(dǎo)合成在一周內(nèi)將回到原來的狀態(tài)。遠程缺血預(yù)處理是一種在遠端器官實行間斷缺血而抗缺血-再灌注損傷的內(nèi)源性保護策略。有觀點認為遠程缺血預(yù)處理晚期是通過募集動員骨髓干細胞而起保護

2、作用。因此，我們設(shè)想遠程缺血預(yù)處理可以激活亞急性梗死心肌的基質(zhì)細胞衍化因子-1的合成表達，同時可以提高細胞移植后的心肌存留率。
　　 方法：通過結(jié)扎雌性重約250-300克Sprague-Dawley大鼠的左前降支冠狀動脈誘導(dǎo)心肌梗死。一周后，超聲心動圖篩查心功能合格的動物進入實驗。遠程缺血預(yù)處理的建立是通過開腹手術(shù)在腹主動脈上實行4個周期5分鐘交替的阻斷和開放完成。其對應(yīng)的假手術(shù)包括開腹和暴露腹主動脈，而不實行阻斷。通過酶聯(lián)免

3、疫吸附實驗、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)和蛋白印跡分別檢測血清、心肌中基質(zhì)細胞衍化因子-1的表達。根據(jù)其時間變化趨勢，確立心肌和血清間最大濃度梯度的時間點，并以此作為細胞移植的時間。移植細胞取源于重約60克的雄性大鼠，分離骨髓間充質(zhì)細胞培養(yǎng)至第三代，以5-溴-2'-脫氧尿苷標記。心梗后一周的雌性大鼠分兩組，分別移植細胞和對照介質(zhì)。每組再分遠程缺血預(yù)處理組、假手術(shù)組和空白手術(shù)組。細胞移植組大鼠從股靜脈注射4×106間充質(zhì)細胞。對照介質(zhì)組接受等體積的

4、磷酸鹽緩沖液注射。一個月以后，進行心功能評價、免疫組化尋找標記的細胞、聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測Y染色體計算心肌中細胞存留率。為了明確基質(zhì)細胞衍化因子-l是否在遠程缺血預(yù)處理作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，腹腔注射特異性CXCR4的免疫球蛋白抗體以阻斷基質(zhì)細胞衍化因子-1/CXCR4軸，同樣方法進行細胞移植，同期比較細胞心臟內(nèi)存留比例。
　　 結(jié)果：總共135只心功能合格的心肌梗死大鼠進入實驗。在亞急性梗死大鼠中，遠程缺血預(yù)處理在術(shù)后1小時誘導(dǎo)血清中

5、基質(zhì)細胞衍化因子-1顯著升高(n=4，P＜0.01)；術(shù)后12-48小時心肌內(nèi)基質(zhì)細胞衍化因子-1基因轉(zhuǎn)錄顯著升高(n=4，P＜0.05)：術(shù)后24小時上調(diào)最明顯（n=4，P＜0.01），同時蛋白表達顯著性提高（n=4，P＜0.01)。因此，遠程缺血預(yù)處理后24小時是心肌與血清間梯度最大的時間點，從而作為細胞移植的時間。細胞移植一個月后，免疫組織化學(xué)和聚合酶聯(lián)反檢測均發(fā)現(xiàn)遠程缺血預(yù)處理組的心內(nèi)細胞滯留率更高(PCR檢測Y染色體數(shù)的細胞滯

6、留比例：0.45±0.12％：0.27±0.09%:0.25±0.07%，n=10，P＜0.01)；遠程缺血預(yù)處理后細胞移植顯著改善梗死后心臟的左室短軸縮短分數(shù)（24.14±4.59%:16.79±4.34%,n=10，P＜0.05）和左室收縮末期內(nèi)徑(5.59±1.11mm:6.99±1.07mm，n=10，P＜0.05)。而特異的CXCR4抗體阻斷能夠降低遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的心內(nèi)高細胞滯留率（0.45±0.12%:0.29±0.09