骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠心功能改善作用機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　由冠心病、心肌病等各種疾病所致的心肌損傷，其最終結(jié)果都將導(dǎo)致有功能的心肌細(xì)胞大量喪失。成年人類的心肌細(xì)胞不能通過自身細(xì)胞再生修復(fù)，只能形成纖維化瘢痕，逐步發(fā)生心室重塑，最終導(dǎo)致心力衰竭。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對干細(xì)胞的深入研究，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)進(jìn)行心肌細(xì)胞成形術(shù)治療心力衰竭成為目前各國學(xué)者研究的熱點。
　　大量動物實驗和臨床觀察已證實，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠促進(jìn)心肌梗死所致心力衰竭的心功能恢復(fù)

2、，但是對于非缺血性心肌病導(dǎo)致的心力衰竭，移植后的效果尚缺乏足夠的動物實驗及臨床實驗依據(jù)，并且對其機(jī)制研究尚少。
　　本實驗通過體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，與體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)與分子生物學(xué)比較，研究其誘導(dǎo)后特性。應(yīng)用阿霉素注射法建立心肌病心衰大鼠模型，成功后心肌內(nèi)移植標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察其對心功能的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　實驗方法
　　1、探討體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后

3、的生物學(xué)特性取雄性Wistar大鼠體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳至一代后經(jīng)10μmol/L的5-氮胞苷體外誘導(dǎo)，免疫組化法觀察細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化，電鏡下觀察細(xì)胞誘導(dǎo)前后超微結(jié)構(gòu)的改變，RT-PCR檢測心肌特異性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表達(dá)，并與體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞比較，觀察二者之間的生物學(xué)異同。
　　2、觀察同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠心臟內(nèi)存活和分化的情況及對心功能的

4、影響雌性Wistar大鼠55只，取正常組(n=10)，應(yīng)用阿霉素注射法建立擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠模型(n=45)，隨機(jī)分成心衰對照組(n=15)，心衰+細(xì)胞移植治療A組(n=15)和心衰+細(xì)胞移植治療B組(n=15).將體外分離培養(yǎng)并誘導(dǎo)后的雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用DAPI標(biāo)記，A組移植誘導(dǎo)前的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，B組移植誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;4周后應(yīng)用血流動力學(xué)方法檢測各組大鼠心功能情況，熒光法觀察移植細(xì)胞存活情況，免疫組化法觀察

5、細(xì)胞分化情況。
　　3、探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌內(nèi)移植對擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠心功能的保護(hù)機(jī)制應(yīng)用阿霉素注射法建立擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠模型，成功后心肌內(nèi)移植DAPI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別于術(shù)后1w、2w、3w、4w進(jìn)行血流動力學(xué)檢測，觀察移植后對大鼠心功能的影響，并于上述時間點取材，利用熒光法觀察移植細(xì)胞的存活情況，利用免疫組化分析心肌膠原纖維的沉積的改變、RT-PCR法觀察血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體flk-1、fl

6、t-1表達(dá)的改變。
　　實驗結(jié)果
　　1、成功進(jìn)行了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)鑒定，免疫組化法證實誘導(dǎo)后部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞α-橫紋肌肌動蛋白和心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T染色表達(dá)陽性，證實已向心肌樣細(xì)胞分化;電鏡下胞漿內(nèi)可見糖原顆粒，肌原纖維排列與原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞相似;RT-PCR證實誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)心肌特異性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。
　　2、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

7、移植4周后移植仍可存活并部分分化成心肌細(xì)胞，表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白肌鈣蛋白T;與心衰對照組比較，細(xì)胞移植組心功能明顯改善，左室收縮壓(LVSP)較心衰對照組升高（122.5±10.2;121.6±11.3vs113.6±12.6）;左室舒張壓(LVDP)降低(17.1±6.1;18.4±5.5vs25.4±8.2);左室最大上升下降速率(±dp/dt)升高（3129.6±214.9;3044.2±295.4vs2378.9±351.1）

8、;(2344.9±114.5;2440.1±96.7vs1994.8±160.1)，p均＜0.05，且A組B組間無差異。
　　3、移植細(xì)胞在各個時間點均存活，并有部分細(xì)胞于術(shù)后4W表達(dá)心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T;于術(shù)后2W開始，移植組心功能較對照組改善，左室收縮壓(LVSP)，左室內(nèi)壓力最大上升及下降速率（±dp/dt）較對照組顯著升高，而左室舒張壓(LVDP)則顯著下降（P均＜0.05）。4w后心肌膠原纖維沉積減少（6.23±0.

9、68vs2.38±0.49，P＜0.01）;VEGF、flt-1、flk-1表達(dá)較同期對照組增加，分別于術(shù)后2w、3w達(dá)到高峰，以后逐漸減弱。
　　討論
　　1、細(xì)胞成形術(shù)是治療心力衰竭的合理途徑。BMMSCs由于自體來源，具備多向分化能力，可能是目前最有希望的供體細(xì)胞來源。研究證實，BMMSCs移植可改善心臟功能，其機(jī)制可能為移植的細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，參與宿主心臟收縮，改善心室功能。BMMSCs向心肌細(xì)胞分化的機(jī)制尚不明確

10、，在體外主要是化學(xué)誘導(dǎo)。本實驗用10μmol/L的5-氮胞苷體外誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。結(jié)果顯示誘導(dǎo)后部分細(xì)胞α-橫紋肌肌動蛋白與肌鈣蛋白T染色陽性，提示BMMSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后有了明確的心肌細(xì)胞化過程。電鏡結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的BMMSCs，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器發(fā)達(dá)，可見糖原顆粒，有明顯的肌原纖維排列，與心肌細(xì)胞電鏡下的結(jié)構(gòu)相似。RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的BMMSCs表達(dá)肌原纖維的主要結(jié)構(gòu)組成成份—α-MHC、β-MHC，表達(dá)心肌

11、特異性因子ANP、BNP，證實分化后的細(xì)胞已經(jīng)具備了心肌細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)和內(nèi)分泌功能。
　　2、BMMSCs移植可以在心肌內(nèi)存活并改善心肌梗塞后受損的心臟功能，但對因非缺血性心肌病導(dǎo)致的心力衰竭，細(xì)胞移植的效果尚缺乏足夠的依據(jù)。本研究將誘導(dǎo)前后的BMMSCs同種異體移植到心肌病心衰大鼠模型體內(nèi)，結(jié)果顯示移植組的心功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組，并且細(xì)胞誘導(dǎo)前后對心功能改善都有明顯的作用，二者之間無差異。BMMSCs改善心功能的作用機(jī)制可能涉

12、及多個方面，其中移植細(xì)胞在宿主心肌內(nèi)存活并向心肌細(xì)胞分化是改善心功能的前提。本研究結(jié)果顯示，未誘導(dǎo)的BMMSCs移植進(jìn)入心肌4周后仍能存活，并有部分細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，表達(dá)心肌特異性蛋白-肌鈣蛋白T。BMMSCs向心肌細(xì)胞分化的機(jī)制在體內(nèi)主要是心肌微環(huán)境誘導(dǎo)。BMMSCs移植入心臟后，局部的心臟環(huán)境，各種因素包括心腔內(nèi)壓力，心臟舒縮的牽拉作用以及電信號傳導(dǎo)刺激等，促發(fā)細(xì)胞間的連接并改變細(xì)胞外的基質(zhì)構(gòu)成，從而誘導(dǎo)其分化，即“組織環(huán)境學(xué)說”

13、。本研究觀察到體內(nèi)外兩種方式均可使BMMSCs向心肌細(xì)胞分化，這可能即為移植誘導(dǎo)前后的BMMSCs對心功能改善無差異的原因。
　　3、本研究表明，細(xì)胞移植組大鼠的心功能有明顯的改善，此種改善作用在移植后3w開始體現(xiàn)，這可能與BMMSCs在宿主體內(nèi)向心肌樣細(xì)胞分化，促進(jìn)宿主細(xì)胞分泌促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子及改善宿主心臟局部結(jié)構(gòu)，提高局部心肌彈力所需的時間有關(guān)。本研究顯示移植組膠原纖維融合較少，排列有序，而對照組膠原纖維融合明顯，排列紊

14、亂，心肌組織的基本結(jié)構(gòu)受到較大的破壞。這表明BMMSCs移植可在一定程度上防止膠原纖維的融合，保護(hù)心肌組織基本結(jié)構(gòu)的有序排列。此外細(xì)胞移植改善心功能的機(jī)制可能還涉及血管生成增加。本研究證實，BMMSCs移植不但能夠上調(diào)肌體血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá)，還能夠上調(diào)VEGF受體Flt-1、Flk-1的表達(dá)，這種表達(dá)可能對持續(xù)促進(jìn)缺血心肌的血管生成起到重要作用。VEGF與其受體的表達(dá)在時間上呈現(xiàn)不同步上調(diào)，可以持續(xù)穩(wěn)定的促進(jìn)血管新生，促進(jìn)缺

15、血心肌的功能恢復(fù);而在后期，移植細(xì)胞引起的血管發(fā)生和心肌細(xì)胞再生有助于進(jìn)一步改善心臟功能。
　　結(jié)論
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)5-氮胞苷定向誘導(dǎo)后在超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子的表達(dá)上類似于心肌細(xì)胞，已向心肌樣細(xì)胞分化。其電生理特性有待于進(jìn)一步研究。
　　2、阿霉素注射法可成功建立擴(kuò)張型心肌病心力衰竭大鼠模型，同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植4周后可存活并部分分化成心肌細(xì)胞，對擴(kuò)張型心肌病心衰大鼠的心功能有保護(hù)作用，細(xì)胞誘導(dǎo)前后對