淋球菌IgA蛋白酶中和表位表達載體的構建及其誘導小鼠的粘膜免疫.pdf

1、【目的】: （1）構建淋球菌IgA蛋白酶中和表位原核表達載體，并在大腸桿菌中誘導表達，純化表達產物6His-IgA蛋白酶中和表位融合蛋白，檢測融合蛋白的免疫原性。 （2）構建淋球菌IgA蛋白酶中和表位真核表達載體，通過生殖道粘膜途徑接種，在動物體內表達相應產物，誘導粘膜免疫，為研制人用高效抗淋病核酸疫苗提供實驗依據(jù)。 【方法】： （1）IgA 蛋白酶中和表位原核表達載體的構建、表達、純化及其免疫原性鑒定通

2、過PCR 擴增淋球菌MS11株IgA蛋白酶編碼基因1 601～2 722位序列，構建pQE30-IgA蛋白酶中和表位原核表達載體；測序正確后在大腸桿菌M15中誘導表達，包涵體重組蛋白經8M尿素變性后通過鎳瓊脂凝膠FF分離純化，SDS-PAGE和Western-Blot分析及鑒定該純化蛋白；后者經尿素濃度梯度透析復性、SDS-PAGE鑒定正確后，與佐劑混合于皮內多點注射免疫新西蘭兔，誘導產生抗淋球菌IgA蛋白酶中和表位的多克隆抗體；以復性

3、后的重組蛋白抗原包板，建立間接ELISA法，檢測兔免疫血清中IgA 蛋白酶中和表位的抗體效價。 （2）構建IgA蛋白酶中和表位真核表達載體，誘導小鼠產生粘膜免疫通過PCR擴增淋球菌MS11株IgA蛋白酶編碼基因1 601-2 722位序列，構建pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位真核表達載體；經鑒定后，制備重組質粒殼聚糖混合顆粒，通過陰道灌注法免疫小鼠，誘導其產生粘膜免疫，對照組免疫不含重組質粒的殼聚糖溶液和pcDNA3

4、.1(-)殼聚糖混合顆粒溶液；第3周和第5周加強免疫一次，間接免疫熒光法檢測目的抗原在小鼠陰道組織內的表達，ELISA法檢測小鼠血清﹑陰道沖洗液中抗IgA蛋白酶中和表位的IgA和IgG類抗體。 【結果】： （1）成功構建了淋球菌IgA蛋白酶中和表位的原核表達載體。通過PCR擴增獲得的淋球菌IgA蛋白酶中和表位序列與GenBank報道的一致。所克隆的基因在大腸桿菌中獲得高效表達，目的蛋白在菌體細胞內以包涵體形式存在，Wes

5、tern-Blot結果顯示該純化蛋白能被抗6-His單抗識別，復性后得到溶解狀態(tài)的復性蛋白。免疫組兔血清中IgA蛋白酶中和表位抗體效價達1:6 400。 （2）成功構建了淋球菌IgA蛋白酶中和表位真核表達載體。以殼聚糖為釋放系統(tǒng)經陰道免疫后第4天開始，通過間接免疫熒光法檢測，在免疫組小鼠陰道上皮細胞中可以觀察到一定亮度的綠色熒光，提示IgA蛋白酶中和表位抗原能在小鼠陰道組織內表達。免疫組小鼠陰道沖洗液中檢測到的抗IgA蛋白酶中和

6、表位的sIgA水平明顯高于對照組。 【結論】： （1）成功構建了淋球菌pQE30-IgA蛋白酶中和表位原核表達載體，免疫動物后獲得了具有較好免疫原性的純化復性IgA蛋白酶中和表位蛋白。 （2）成功構建了淋球菌pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位真核表達載體，其殼聚糖混合顆粒經陰道免疫小鼠，能誘導產生有效的生殖道粘膜免疫。 （3）pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位蛋白能在小鼠陰道上皮組織內