大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷制備方法的探索.pdf

1、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷存在于大黃、何首烏、虎杖等中藥中，近年的研究表明其對(duì)腦中真性乙酰膽堿酯酶活力具有可逆性的抑制作用，可提高中樞的乙酰膽堿含量，而且，對(duì)海馬神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用，因此，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷既是一種真性乙酰膽堿酯酶可逆性抑制劑，又是海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)劑，對(duì)老年性癡呆等疾病的發(fā)生和發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)有改善作用。大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷顯著改善由東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，并顯著提高

2、正常小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得能力，與陽(yáng)性藥物石杉?jí)A甲比較，兩者無(wú)顯著性差異。因此，利用大黃素-8-P-β-D-葡萄糖苷來(lái)防治老年性癡呆癥或提高智力有良好的開發(fā)前景。 自然界含有大黃素的中藥材(虎杖、何首烏、大黃、決明子等)中多含有一定量的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，但含量較低。目前，生物轉(zhuǎn)化已成為天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾和改造的有利工具，它是利用生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶對(duì)外源性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造的化學(xué)反應(yīng)。具有選擇性高、條件溫和、無(wú)污染

3、、成本低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。因此，本課題欲通過(guò)生物技術(shù)制備大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，研制開發(fā)防治老年性癡呆的藥物，對(duì)已逐漸進(jìn)入老年化的當(dāng)今社會(huì)具有不可低估的意義。 第一部分文獻(xiàn)研究 一、對(duì)何首烏、虎杖中的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行綜述； 二、對(duì)生物轉(zhuǎn)化及生物酶法提取在中藥中的應(yīng)用及進(jìn)展進(jìn)行綜述。 第二部分大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷制備方法的研究 第一章經(jīng)典方法制備大黃素-8-O-β-D-葡

4、萄糖苷采用溶劑回流提取-柱色譜分離法分別從中藥何首烏和虎杖中分離得到大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷,大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷，大黃素及白藜蘆醇苷。 第二章生物法制備大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷 一、植物培養(yǎng)物對(duì)大黃素的生物轉(zhuǎn)化制備大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷首次采用植物培養(yǎng)物對(duì)大黃素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并以轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)篩選出最佳的轉(zhuǎn)化條件。 首次建立長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中大黃素-8-O-β-D-

5、葡萄糖苷含量測(cè)定的方法：色譜柱：Diamonsil<'TM>(鉆石)C<,18>色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)； 流動(dòng)相：甲醇-水-甲酸(70：29.6：0.4)V/V；流速：1mL·min<'-1>；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：室溫?；貧w方程：Y=3E+06X-54.143，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的線性范圍：0.015μg～0.075μg。 二、生物酶法從中藥材中提取結(jié)合葸

6、醌的最佳工藝篩選首次采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化篩選用纖維素酶法從大黃中提取結(jié)合葸醌的最佳工藝。以結(jié)合葸醌平均含量(％)和干膏率的平均值為兩指標(biāo)，采用加權(quán)法來(lái)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)合葸醌平均含量(％)的得分(X)的權(quán)為60％，干膏率平均值的得分(Y)的權(quán)為40％，綜合評(píng)分為Z=60％X+40％Y，最佳工藝40℃，酶解1h，pH=7。 三、微生物酶轉(zhuǎn)化法外源物質(zhì)6-乙酰大黃素制備實(shí)驗(yàn)條件 篩選6-乙酰大黃素是微生物酶轉(zhuǎn)化制備大黃素-8-O-β

7、-D-葡萄糖苷的外源物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用單因素法、以IR光譜測(cè)定結(jié)果及TLC結(jié)果為參考，篩選出制備6-乙酰大黃素的最佳條件：取精制大黃素置三角瓶中，50℃干燥1h，以大黃素-試劑(1：3)加入醋酐，于沸水浴回流，迅速加入冷水，振搖，冰箱放置，抽濾，水洗，50℃干燥，即得。 第三部分何首烏藥材中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量測(cè)定 首次建立何首烏藥材中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量測(cè)定的方法：色譜柱：Diamon

8、sil<'TM>(鉆石)C<,18>色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-甲酸(70：29.6：0.4)V/V；流速：1mL·min<'-1>；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：室溫。回歸方程：Y=3E+06X+2187.5，相關(guān)系數(shù)為r=0.9999，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷線性范圍在0.060μg～0.300μg。含量測(cè)定結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性，回收率合格，可用于測(cè)定何首烏中大黃