mPTP在腦缺血后處理保護(hù)效應(yīng)機(jī)制中的作用研究.pdf

1、近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后，再灌注前，反復(fù)行數(shù)次短暫再灌注/缺血能明顯減輕腦的梗死容積，減少再灌注損傷，具有腦保護(hù)作用，此現(xiàn)象被稱(chēng)為“缺血后處理”（Ischemic Postconditioning,IPost）。IPost作為減輕腦缺血再灌注損傷的新型干預(yù)措施，如何實(shí)施才能達(dá)到有效腦保護(hù)效應(yīng)，目前仍未可知。
　　線粒體敏感性轉(zhuǎn)化孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore,mPTP）是線

2、粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道，在再灌注早期開(kāi)放，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。心肌IPost的機(jī)制研究提示，mPTP在IPost對(duì)心肌的保護(hù)作用中扮演重要的角色，可能是IPost保護(hù)機(jī)制的共同通路，然而，mPTP在腦IPost的作用如何，目前仍需進(jìn)一步的探索和研究。因此，本研究正是利用大鼠中動(dòng)脈阻閉模型（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO），探尋和篩選腦IPost保護(hù)作用的有效時(shí)間，并且以mPTP為切入點(diǎn)

3、，初步探討腦IPost的保護(hù)機(jī)制。
　　第一部分，腦IPost保護(hù)作用的時(shí)間方案篩選及與缺血預(yù)處理比較
　　方法：
　　1.缺血后處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的時(shí)間方案篩選
　　健康雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（缺血90min）和IPost不同時(shí)間點(diǎn)組（缺血90min后，分別在15s/30s/1min/2min/5min進(jìn)行再灌注/缺血處理，反復(fù)三次）。所有動(dòng)物再灌注24h行神經(jīng)功能障礙評(píng)分

4、。24h后處死動(dòng)物，TTC染色以確定梗死容積。
　　2.缺血后處理與缺血預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)的比較
　　30只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組，IPost組和缺血預(yù)處理組（IschemicPretconditioning,IPC）組（缺血20min，再灌注24h后行MCAO90min）。所有動(dòng)物再灌注24h行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。24h處死動(dòng)物，TTC染色確定梗死容積。
　　結(jié)果：
　　術(shù)后所有動(dòng)物都存活。缺血再灌注后大鼠均

5、表現(xiàn)一定的神經(jīng)功能障礙。
　　1.缺血再灌注24h后，IPost-15s/30s/1min/2min組神經(jīng)功能障礙評(píng)分與對(duì)照組相比顯著降低，尤以IPost-15s組低于其它各組，而IPost-5min組與對(duì)照組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注24h腦梗死容積百分比：IPost-15s組，IPost-30s組，IPost-1min組和IPost-2min組分別明顯小于對(duì)照組，而IPost-5min組與對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IPos

6、t-15s組腦梗死容積顯著小于其它各組。最后確定IPost-15s組做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
　　2.IPost組和IPC組神經(jīng)功能障礙評(píng)分顯著低于對(duì)照組。IPost組和IPC組腦梗死容積小于對(duì)照組。但I(xiàn)Post組腦梗死容積大于IPC組。
　　第二部分，mPTP在腦缺血后處理保護(hù)機(jī)制中的作用研究
　　方法：
　　1．mPTP開(kāi)放劑蒼術(shù)苷最低有效劑量的篩選
　　再灌注前10min側(cè)腦室注射不同濃度的mPTP開(kāi)放劑蒼

7、術(shù)苷（Atractyloside,Atr），以確定可以促使mPTP開(kāi)放的最低有效劑量。
　　30只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組，Atr-1組（4mmol/L，15μl），Atr-2組（2mmol/L，15μl）；再灌注24h行Garcia神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。24h后處死動(dòng)物，TTC染色以確定梗死容積。
　　2．在體實(shí)驗(yàn)確定mPTP在腦缺血后處理保護(hù)效應(yīng)中的作用
　　利用側(cè)腦室注射mPTP的關(guān)閉劑環(huán)孢菌素A（Cyclos

8、porinA,CsA）和開(kāi)放劑Atr來(lái)確定mPTP在腦IPost保護(hù)中的作用。
　　70只SD大鼠隨機(jī)分為7組。溶劑組（100％乙醇），對(duì)照組，對(duì)照組＋CsA（2μmol/L，15μl再灌注前10min給予），對(duì)照組＋Atr（再灌注前15min給予）；IPost組，IPost+CsA（2μmol/L，15μl再灌注前10min給予），IPost+Atr（再灌注前15min給予）。所有動(dòng)物分別再灌注24h、48h和72h行Garci

9、a神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。72h后處死動(dòng)物，TTC染色確定腦梗死容積。
　　3．透射電鏡下觀察腦缺血后處理保護(hù)效應(yīng)中線粒體的超微結(jié)構(gòu)
　　實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)驗(yàn)2，待模型制作成功后，再灌注72h后取損傷側(cè)海馬組織，通過(guò)透射電鏡觀察腦組織線粒體的超微結(jié)構(gòu)。
　　4.離體實(shí)驗(yàn)近一步證實(shí)mPTP在腦缺血后處理保護(hù)效應(yīng)中的作用
　　利用分光光度計(jì)檢測(cè)mPTP開(kāi)放和關(guān)閉的程度。
　　70只SD大鼠隨機(jī)分為7組。90min單純?nèi)毖?/p>

10、組，其余分組同實(shí)驗(yàn)2。所有動(dòng)物于再灌注15min后提取線粒體，利用分光光度計(jì)在520nm波長(zhǎng)下所測(cè)得吸光度值來(lái)檢測(cè)mPTP開(kāi)放和關(guān)閉的程度。
　　結(jié)果：
　　1．缺血再灌注24h后，Atr-1組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分與對(duì)照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Atr-2組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分顯著大于Atr-1組。再灌注24h腦梗死容積百分比：Atr-1組明顯大于對(duì)照組，而Atr-2組腦梗死容積百分比顯著低于Atr-1組。最后確定Atr為2mmo

11、l/L，15μl作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。
　　2.在再灌注的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，對(duì)照組＋CsA和IPost組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組。IPost+Atr神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分與IPost組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而IPost+CsA神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分與IPost組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注72h后，對(duì)照組＋CsA和IPost組的腦梗死容積顯著低于對(duì)照組。IPost+Atr腦梗死容積顯著大于IPost組。而IPost+CsA腦梗死容積與IPost

12、組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組和溶劑組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3．通過(guò)透射電鏡可以觀察到正常線粒體呈桿狀，結(jié)構(gòu)完整，外膜平滑光整，線粒體嵴排列整齊，并且清晰可見(jiàn)；對(duì)照組和加入Atr組的線粒體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，線粒體腫脹，線粒體嵴消失，內(nèi)部空泡化。而IPost組和加入CsA組線粒體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本完整，線粒體嵴排列整齊，線粒體膜清晰可見(jiàn)。
　　4.與單純?nèi)毖M相比，其它各組吸光度的改變值明顯升高；加入CsA組的吸光度改變值明顯低于對(duì)照組

13、；加入Atr組的吸光度改變值明顯高于IPost組。但I(xiàn)Post＋CsA與IPost組相比，吸光度的改變值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.缺血后處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用時(shí)間為15s再灌注/缺血，反復(fù)三次。缺血后處理的腦保護(hù)效應(yīng)略弱于缺血預(yù)處理。
　　2.腦缺血后處理可以抑制腦的缺血再灌注損傷，改善線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，最終起到腦的保護(hù)作用。
　　3.腦缺血后處理的部分機(jī)制可能是通過(guò)再灌注早期抑制