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文檔簡介
1、第一部分:自噬應(yīng)激參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷機制
目的:構(gòu)建C57BL小鼠1-甲基,4-苯基,1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl–4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)急毒模型,觀察帕金森病(Parkinson disease,PD)小鼠中的自噬水平,并深入研究自噬在PD發(fā)病機制中的作用。
方法:14mg/kg MPTP腹腔注射(1d內(nèi)分4次注射,每次間隔2h),構(gòu)
2、建C57BL小鼠MPTP急毒模型;同時采用雷帕霉素4mg/kg腹腔注射預(yù)處理給藥3次作為自噬誘導(dǎo)劑預(yù)處理組。在造模后第7d對各處理組小鼠進行行為學(xué)評定(小鼠爬桿檢測、小鼠轉(zhuǎn)棒耐力檢測)。免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠黑質(zhì)及紋狀體TH蛋白表達變化,透射電鏡觀察中腦黑質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。Western blot檢測中腦黑質(zhì) TH和α-synuclein蛋白表達變化,自噬特異性蛋白微管相關(guān)膜蛋白輕鏈3(microtubule-associated
3、protein light chain3,LC3)和自噬底物蛋白P62的表達變化。
結(jié)果:(1)MPTP造模7d可引起小鼠爬桿時間延長,轉(zhuǎn)棒潛伏期縮短,自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可緩解MPTP導(dǎo)致的小鼠行為學(xué)功能損傷。(2)MPTP造模7d后,小鼠黑質(zhì)及紋狀體 TH陽性細(xì)胞減少,且中腦黑質(zhì) TH蛋白表達顯著降低,α-synuclein表達增加,而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可緩解MPTP導(dǎo)致的小鼠DA能神經(jīng)元損傷。(3)MPTP造模7d,小鼠中
4、腦黑質(zhì)可見線粒體腫脹損傷,同時可見雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu),而雷帕霉素預(yù)處理組可見較多的自噬體結(jié)構(gòu)和溶酶體。(4) MPTP造模7d小鼠中腦黑質(zhì)LC3-II蛋白表達增加,P62的表達也顯著增加;雷帕霉素預(yù)處理可進一步上調(diào)LC3-II蛋白表達,同時減少P62蛋白的表達。
結(jié)論: MPTP引起的自噬應(yīng)激參與了PD小鼠的發(fā)病機制。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理可上調(diào)自噬水平,促進自噬流完成,改善 MPTP引起的自噬功能障礙,促進α-synucl
5、ein自噬降解從而對DA能神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。
第二部分:自噬在帕金森病増齡易感性中的作用
目的:構(gòu)建不同月齡C57BL小鼠MPTP急毒模型,觀察MPTP對不同月齡組PD小鼠的損傷作用,并研究自然増齡條件下自噬水平的變化及自噬在不同月齡PD小鼠發(fā)病機制中的作用。
方法:3月齡和16月齡C57BL小鼠,均分為生理鹽水對照組和PD模型組。在造模后第1、4、7天對各處理組小鼠進行行為學(xué)評定(小鼠爬桿檢測、小鼠轉(zhuǎn)棒
6、耐力檢測)。MPTP造模7d后免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠黑質(zhì)及紋狀體TH蛋白表達變化,透射電鏡觀察中腦黑質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,Western blot檢測中腦黑質(zhì)TH和α-synuclein蛋白表達變化,自噬特異性蛋白LC3、自噬底物蛋白P62和組蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase6,HDAC6)蛋白的表達變化。
結(jié)果:(1)與3月齡PD小鼠相比,16月齡PD小鼠在MPTP造模后1、4、7d爬桿時間均顯著延長
7、,且在MPTP給藥第7d具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異;但小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期在不同月齡PD小鼠沒有統(tǒng)計學(xué)差異。(2)MPTP造模后7d,與3月齡PD小鼠相比,16月齡PD小鼠黑質(zhì)和紋狀體TH陽性細(xì)胞的缺失較為明顯,TH蛋白表達也較低,α-synuclein的表達則顯著增加。(3)MPTP造模7d后16月齡小鼠中腦黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見較多的脂褐素沉積,線粒體腫脹空泡化,且可見較多的變性神經(jīng)元。(4)與3月齡生理鹽水對照組相比,16月齡生理鹽水對照組LC3-II
8、和HDAC6的表達下降,P62的表達增加。(4)MPTP造模7d后,與16月齡生理鹽水對照組相比,16月齡PD小鼠LC3-II、 P62和HDAC6的蛋白表達雖有增加但沒有統(tǒng)計學(xué)差異;且與3月齡PD小鼠相比,16月齡PD小鼠LC3-II和HDAC6的蛋白表達顯著下降。
結(jié)論:老化可加劇DA能神經(jīng)元損傷,16月齡小鼠對MPTP誘導(dǎo)損傷存在較高的敏感性。小鼠中腦黑質(zhì)的自噬水平存在隨齡性下降趨勢。在3月齡小鼠中HDAC6介導(dǎo)的自噬應(yīng)
9、激可減弱MPTP引起的毒性作用,而16月齡小鼠的自噬失代償導(dǎo)致了老齡小鼠對MPTP毒性作用的増齡敏感性。
第三部分:帕金森病増齡易感性的自噬調(diào)控機制
目的:構(gòu)建不同月齡C57BL小鼠MPTP急毒模型,觀察自噬靶向藥物雷帕霉素和海藻糖對不同月齡組PD小鼠DA能神經(jīng)元損傷的保護作用,并研究它們對不同月齡PD小鼠自噬的調(diào)控機制。
方法:3月齡和16月齡C57BL雄性小鼠,均分為正常對照組、PD模型組、雷帕霉素溶劑
10、對照組、雷帕霉素高劑量組、雷帕霉素中劑量組、雷帕霉素低劑量組和海藻糖組。在造模后第7d對各處理組小鼠進行小鼠爬桿實驗,透射電鏡觀察中腦黑質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。Western blot檢測中腦黑質(zhì)TH和α-synuclein蛋白表達變化,自噬特異性蛋白LC3、自噬底物蛋白P62、HDAC6蛋白及溶酶體相關(guān)膜蛋白1(Lysosome-associated membrane protein-1,LAMP1)的表達變化。
結(jié)果:(1)高
11、、中、低三個不同劑量的雷帕霉素治療后,均可緩解3月齡和16月齡PD小鼠爬桿時間的延長,但雷帕霉素改善行為學(xué)的作用在3月齡PD小鼠與其劑量大小成反比。(2)高、中劑量雷帕霉素治療可誘導(dǎo)3月齡和16月齡PD小鼠中腦黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)形成自噬體。(3)雷帕霉素激活16月齡 PD小鼠自噬流和HDAC6的水平與其劑量大小成正比,高劑量的雷帕霉素治療3月齡PD小鼠雖可較高地上調(diào)LC3-II和HDAC6水平,但其誘導(dǎo)的自噬流功能卻并不是最強的。(4)不同劑量
12、雷帕霉素均可上調(diào)3、16月齡小鼠 LAMP1的表達,且此作用在3月齡PD小鼠與其劑量大小成反比。(5)1mg/kg海藻糖可通過激活自噬流和溶酶體,促進α-synuclein自噬降解,進而對3月齡PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用,但它對16月齡PD小鼠卻沒有作用。
結(jié)論:雷帕霉素和海藻糖治療能夠緩解3月齡PD小鼠的DA能神經(jīng)元損傷,其機制與誘導(dǎo)自噬流促進α-synuclein自噬降解有關(guān)。在3月齡PD小鼠,鑒于低劑量雷帕霉素能夠協(xié)同上調(diào)
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