ROCK抑制劑—法舒地爾對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察Rho激酶抑制劑-法舒地爾和RNAi介導(dǎo)的RhoA基因沉默對(duì)大鼠脊髓損傷的修復(fù)作用及其對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞增殖的影響。為臨床治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法:體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,雪旺細(xì)胞根據(jù)處理因素不同分各為六組(每組設(shè)六個(gè)副孔):A為空白對(duì)照組,B加5μmol/L法蘇地爾,C加10μmol/L法蘇地爾,D加15μmol/L法蘇地爾,E加20μmol/L法蘇地爾,

2、F經(jīng)siRNA沉默RhoA基因組。相應(yīng)處理后第3天,用RT-PCR,Western blot檢測(cè)各組神經(jīng)干細(xì)胞RhoA基因和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布的變化。連續(xù)5天用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):雌性SD大鼠60只,體重200-250g,以半切法制成脊髓半橫斷模型。隨機(jī)分成3組A組為單純損傷組,B組為法舒地爾治療組,C組RhoA基因沉默治療組。于傷后1w、2w、4

3、w、6w、8w進(jìn)行BBB評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)等運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)。第4周取材行病理切片HE染色RT-PCR,Western blot檢測(cè)各組脊髓組織RhoA基因和蛋白的表達(dá)。8周后取材,行辣根過(guò)氧化物酶示蹤觀察(HRP)及通過(guò)體感誘發(fā)電位觀察神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:給予相應(yīng)處理3天后神經(jīng)干細(xì)胞D,E,F組與A,B,C組相比RhoA基因和蛋白表達(dá)量明顯降低,細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯增快,細(xì)胞周期G0/G1期減少,S期細(xì)胞數(shù)增多

4、。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E組與F組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。處理3天后雪旺細(xì)胞D,E,F組與A,B,C組相比RhoA基因和蛋白表達(dá)量明顯降低,細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯增快,細(xì)胞周期G0/G1期減少,S期細(xì)胞數(shù)增多。各組間異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E組與F組相比RhoA基因和蛋白表達(dá)量有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:傷后4周B、C兩組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能均有較明顯恢復(fù),C組較B組為快,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組亦有所恢復(fù),但程度較輕。病理觀察A組未見神經(jīng)軸

5、索通過(guò),B組和C組可見少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)。B,C組與A相比RhoA基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低,B組較C組降低的更明顯。HRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)B,C組較A組多。B組略多于C組。B,C組大鼠體感誘發(fā)電位的潛伏期、波幅優(yōu)于A組,B組略優(yōu)于C組。
　　 結(jié)論:Rho激酶抑制劑法舒地爾和RNAi介導(dǎo)的RhoA基因沉默的研究表明:在體外實(shí)驗(yàn)均能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞/雪旺細(xì)胞的增殖。但是,神經(jīng)干細(xì)胞組給予法舒地爾最佳濃度處理和RNA干擾處理沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)