復(fù)方茯苓甘草湯有效成分分離及其防治慢性常壓低氧性肺動(dòng)脈高壓的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的] 本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方茯苓甘草湯為研究對(duì)象，以防治慢性常壓低氧性肺動(dòng)脈高壓(PAH)的效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立HP20型大孔吸附樹(shù)脂分離復(fù)方茯苓甘草湯水煎液的提取工藝條件，進(jìn)行復(fù)方茯苓甘草湯水煎液的有效成分(群)/有效部位(群)的提取分離，尋找該方防治慢性PAH的物質(zhì)基礎(chǔ)并進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的防治慢性PAH的中藥復(fù)方制劑奠定基礎(chǔ)。 [方法] 實(shí)驗(yàn)分藥液組分分離階段、藥液組分篩選階段和動(dòng)物模型驗(yàn)證階段三個(gè)階段

2、。 1.藥液組分分離階段：用HP20型大孔吸附樹(shù)脂分離復(fù)方茯苓甘草湯全方水煎液，分別用蒸餾水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇洗脫，得到相應(yīng)的四部分，揮盡溶劑后以蒸餾水轉(zhuǎn)溶，調(diào)正體積，罐封冷藏，供藥液組分篩選階段和動(dòng)物模型驗(yàn)證階段備用。 2.藥液組分篩選階段：64只SPF級(jí)Spraque-Dawley系3月齡健康雄性大鼠，體重200-220g，自由進(jìn)水進(jìn)食，依據(jù)隨機(jī)分配表以及正交設(shè)計(jì)方法分為16組，每組4只。采用常壓間

3、斷低氧連續(xù)21天的方法復(fù)制慢性常壓低氧性PAH大鼠模型，每天缺氧8小時(shí)。每天缺氧前予相應(yīng)的藥液5ml/只灌胃處理，藥液由藥液組分分離階段來(lái)制備，并分別按照正交表配定。檢測(cè)大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)；計(jì)算肺滲出指數(shù)(wW/BW)及右心肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]；觀察并計(jì)數(shù)每張切片中直徑(50～200)μm的肺血管肌型動(dòng)脈(MA)、部分肌型動(dòng)脈(PMA)、無(wú)肌型動(dòng)脈(NMA)的數(shù)目，計(jì)算各占肺血管總數(shù)的百分比(即三型肺小動(dòng)脈所占的比例

4、)；分析肺腺泡內(nèi)直徑(50～200)μm肌型動(dòng)脈(MA)的圖像，測(cè)定管腔面積、中膜面積，計(jì)算中膜面積與管腔面積比值(MA/LA)。所得的數(shù)據(jù)依照正交設(shè)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繼而篩選出合適的組分。 3.動(dòng)物模型驗(yàn)證階段：77只SPF級(jí)Spraque-Dawley系3月齡健康雄性大鼠，體重200～220g，自由進(jìn)水進(jìn)食，隨機(jī)分為7組，每組11只：A組(空白組)、B組(模型組)、C組(蒸餾水洗脫液提取物防治組，簡(jiǎn)稱蒸洗液組)、D組(3

5、0％乙醇洗脫液提取物防治組，簡(jiǎn)稱30％液組)、E組(60％乙醇洗脫液提取物防治組，簡(jiǎn)稱60％液組)、F組(95％乙醇洗脫液提取物防治組，簡(jiǎn)稱95％液組)、G組(復(fù)方茯苓甘草湯全方防治組，簡(jiǎn)稱全方組)。每天灌以相應(yīng)的藥物5ml/只，其中A組、B組灌生理鹽水，其余各組所用的藥液由藥液組分分離階段來(lái)制備。A組不造模，只灌胃，連續(xù)21天；其余各組均采用常壓間斷低氧連續(xù)21天的方法復(fù)制慢性常壓低氧性PAH大鼠模型，每天先灌胃，再缺氧8小時(shí)，連續(xù)2

6、1天。檢測(cè)指標(biāo)同藥液組分篩選階段。所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選并驗(yàn)證合適的組分。 [結(jié)果] 1.藥液組分分離階段，分離得到四種提取物，即蒸餾水洗脫液提取物、30％乙醇洗脫液提取物、60％乙醇洗脫液提取物、95％，乙醇洗脫液提取物，分別簡(jiǎn)稱為蒸洗液、30％液、60％液、95％液。 2.藥液組分篩選階段，依實(shí)驗(yàn)證據(jù)分析，結(jié)果如下： 2.1尚不能認(rèn)為第8組(蒸洗液)與第12組(30％液)對(duì)大鼠模型mPAP、R

7、V/(LV+S)、wW/BW和三型肺小動(dòng)脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P>0.05)，不能使mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW降低。光鏡下見(jiàn)第8、12組大鼠模型肺小動(dòng)脈的病變情況符合慢性PAH的基本病理特征。 2.2可認(rèn)為第14組(60％液)與第15組(95％液)對(duì)大鼠模型mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW和三型肺小動(dòng)脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P<0.05或P<0.01)，能使mPAP、RV/

8、(LV+S)、wW/BW、MA(％)、PMA(％)和MA/LA降低，NMA(％)則升高。光鏡下見(jiàn)第15組大鼠模型肺小動(dòng)脈的病變情況較第8組與第12組減輕，也較第14組顯著好轉(zhuǎn)。 2.3尚不能認(rèn)為第4組(蒸洗液+30％液)、第6組(蒸洗液+60％液)、第7組(蒸洗液+95％液)、第10組(30％液+60％液)、第11組(30％液+95％液)、第13組(60％液+95％液)這六個(gè)組所產(chǎn)生的交互作用，對(duì)大鼠模型mPAP、RV/(LV+

9、S)、wW/BW、三型肺小動(dòng)脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P>0.05)。也即尚不能認(rèn)為蒸洗液、30％液、60％液、95％液這四種提取液之間的一級(jí)交互作用對(duì)大鼠模型上述指標(biāo)有影響。 2.4尚不能認(rèn)為第2組(蒸洗液+30％液+60％液)、第3組(蒸洗液+30％液+95％液)、第5組(蒸洗液+60％液+95％液)、第9組(30％液+60％液+95％液)這四個(gè)組所產(chǎn)生的交互作用，對(duì)大鼠模型mPAP、RV/(LV+S)、wW/

10、BW、三型肺小動(dòng)脈所占的比例以及MA/LA有影響(它們的P>0.05)。也即尚不能認(rèn)為蒸洗液、30％液、60％液、95％液這四種提取液之間的二級(jí)交互作用，對(duì)大鼠模型上述指標(biāo)有影響。 3.動(dòng)物模型驗(yàn)證階段，依實(shí)驗(yàn)證據(jù)分析，結(jié)果如下： 3.1 B組(模型組)大鼠的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(％)、PMA(％)以及MA/LA比A組(空白組)的均明顯升高，而NMA(％)則明顯降低(P<0.01)。光鏡下見(jiàn)B組

11、肺小動(dòng)脈病變情況符合慢性PAH的基本病理特征。 3.2 經(jīng)治療后C組(蒸洗液組)、D組(30％液組)的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(％)、PMA(％)以及MA/LA均稍低于B組的，而NMA(％)則稍高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。光鏡下見(jiàn)這兩組的肺小動(dòng)脈病變情況基本符合慢性PAH的基本病理特征。 3.3 經(jīng)治療后E組(60％液組)、F組(95％液組)與G組(全方組)的mPAP、RV/(LV+S)

12、、MA/LA均明顯下降(和B組比較P<0.01)；但E組的未能恢復(fù)到A組水平(P<0.01)；而F組與G組的雖稍高于A組的，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)治療后E組、F組與G組的wW/BW均明顯下降(與B組比較P<0.01)，但未能恢復(fù)到A組水平(P<0.01)。經(jīng)治療后E組、F組、G組的MA(％)、PMA(％)均有下降，而NMA(％)則明顯升高(與B組比較P<0.01)。但這三組的MA(％)和E組的PMA(％)均未能降低到A組

13、水平(P<0.01)，而NMA(％)均未能升高到A組水平(P<0.01)。而F組與G組的PMA(％)與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。光鏡下見(jiàn)，經(jīng)治療后E組、F組、G組的肺小動(dòng)脈的病變情況較B組明顯減輕，總體改善以G組相對(duì)最明顯。 [結(jié)論] 1、用HP20型大孔吸附樹(shù)脂將復(fù)方茯苓甘草湯全方水煎液分離，可得到相應(yīng)的四種提取液，即蒸餾水沈脫液提取物、30％乙醇洗脫液提取物、60％乙醇洗脫液提取物、95％乙醇洗脫液提

14、取物，分別簡(jiǎn)稱為蒸洗液、30％液、60％液、95％液。分離的條件如下：上樣濃度為0.6g生藥·ml-1；按生藥量：樹(shù)脂量=1:(1～3)；柱子的徑高比為5cm:25cm，即1:5；吸附流速為(1～5)ml·min-1；靜態(tài)吸附時(shí)間30 min；洗脫濃度為蒸餾水、30％、60％、95％乙醇；洗脫劑用量為大約用3倍樹(shù)脂體積；洗脫速度為(20～75)滴·min-1即(1～5)ml·min。 2、對(duì)慢性常壓缺氧性PAH大鼠模型而言，蒸洗

15、液、30％液、60％液、95％液這四種提取液之間沒(méi)有協(xié)同防治作用。 3、對(duì)慢性常壓缺氧性PAH大鼠模型而言，蒸洗液、30％液是沒(méi)有防治作用的，是復(fù)方茯苓甘草湯全方中的雜質(zhì)部分，可去除；而60％液、95％液是有防治作用的，可以認(rèn)為它們是復(fù)方茯苓甘草湯防治該大鼠模型的主要的有效成分(群)。也就是說(shuō)，可以認(rèn)為復(fù)方茯苓甘草湯防治慢性常壓缺氧性PAH大鼠模型的主要物質(zhì)基礎(chǔ)存在于60％液、95％液這兩種提取液中；95％液較60％液而言，可能