抗HBV藥物體外篩選及鹽酸千金藤堿體外抗HBV作用及機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 目前，乙型肝炎屬全球性威脅人類健康的一種較嚴(yán)重的傳染性疾病。在全世界約有20多億人曾感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)，其中3.5億以上為慢性乙型肝炎病毒感染者，每年由于HBV感染而死亡的人數(shù)達100萬?，F(xiàn)有的治療乙型肝炎藥物有干擾素、核苷類藥物、胸腺素，但這些藥物長期應(yīng)用會出現(xiàn)較嚴(yán)重的毒副作用或產(chǎn)生耐藥，且價格昂貴。因此，尋找新型、安全、有效的抗HBV藥物是醫(yī)藥學(xué)工作者急需解決的

2、問題。
　　 野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.，F(xiàn)CI)的干燥頭狀花序。野菊花的主要成分為萜類、黃酮類、揮發(fā)油等。野菊花能增加冠脈血流，降低血壓，抑制血小板聚集，增強免疫功能。另外，野菊花還有抗微生物、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用。野菊花及復(fù)方制劑可用于預(yù)防和治療呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、皮膚等的感染性疾病等。鹽酸千金藤堿(CepharanthineHydrochloride，CH)是從防己

3、科千金藤屬植物塊根中提取分離出的單體雙芐基異喹啉類生物堿，經(jīng)成鹽而得，具有抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、升高白細胞、鎮(zhèn)痛、誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性等多種生物學(xué)活性。但是兩者抗HBV方面的研究，尚未見報道。
　　 本論文的研究目的是從野菊花提取物及CH中篩選出具有抗HBV活性的藥物，進一步進行抗HBV機制研究，為其開發(fā)為臨床治療藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 本課題采用HBV基因轉(zhuǎn)染的人

4、肝癌細胞HepG2.2.15細胞為篩選模型，以HBsAg和HBeAg為指標(biāo)對野菊花提取物及CH等樣品進行體外抗HBV活性篩選，對篩選出有抗HBV活性的化合物，進一步檢測對細胞上清液及細胞內(nèi)HBVDNA拷貝數(shù)的影響，并初步研究其作用機制本研究共分兩部分，其內(nèi)容如下：
　　 第一部分抗HBV藥物體外篩選研究
　　 選用拉米夫定(Lamivudine，3TC)為陽性藥，通過甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析法檢測樣品對HepG2.

5、2.15細胞的毒性，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測用藥物干預(yù)后第3、6、9天細胞上清液中的HBsAg、HBeAg的變化，以細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)、半數(shù)抗原分泌抑制濃度(IC50)、治療指數(shù)TI(TI=TC50/IC50)為指標(biāo)，評價6種受試物的體外抗HBV活性。
　　 第二部分CH體外抗HBV作用及其機制研究
　　 通過MTT法確定CH對HepG2.2.15細胞的TC50，選取一系列低于TC50的CH作為進一步

6、篩選濃度，分別依次為6.4μg·ml-1、3.2μg·ml-1和1.6μg·ml-1。用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)法檢測CH在用藥后第9天對細胞內(nèi)外HBV DNA拷貝數(shù)的影響，計算出CH對HepG2.2.15細胞上清液中及細胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)的IC50，根據(jù)TI，判斷CH體外抗HBV效果。并在HepG2.2.15細胞平臺上對CH是否具有抑制HBV cccDNA的作用進行評估，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測CH對H

7、epG2.2.15細胞HBV聚合酶(Polymerase，P)基因mRNA表達的活性。
　　 結(jié)果：
　　 1：通過篩選，有3種受試藥物對HBVHBsAg和HBeAg的TI>1。
　　 2：CH在體外對HepG2.2.15細胞有一定的細胞毒性，其TC50約為6.58μg·ml-1；對HBsAg和HBeAg分泌的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為4.50、4.27μg·ml-11，治療指數(shù)(TI)分別為1.46、1.5

8、4；對細胞上清液中HBV DNA拷貝數(shù)的IC50為2.24μg·ml-1，對細胞內(nèi)HBVDNA拷貝數(shù)的IC50為2.73μg·ml-1，TI值分別為2.94、2.41；CH對細胞內(nèi)HBV cccDNA的抑制作用較明顯，6.4μg·ml-1CH對細胞內(nèi)HBV cccDNA的抑制率達到92.4％；RT-PCR檢測結(jié)果表明，高劑量CH對HBV P基因的mRNA表達抑制作用與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.01)，并且抑制作用強于陽性藥3T