紫紅獐牙菜化學成分的含量測定及體外抗HBV活性物質的篩選.pdf

1、目的：篩選紫紅獐牙菜抗乙肝病毒的有效部位和化學成分，闡明抗乙肝病毒活性物質基礎；建立藥材多種有效成分的HPLC含量測定方法，為藥材質量評價提供科學依據。 方法：采用乙肝病毒基因組轉染的人肝癌細胞(HepG2)2.2.15細胞為細胞模型，樣品臨用前溶于DMSO配成適當濃度，檢測時用培養(yǎng)液作2倍或3倍稀釋。將2.2.15細胞接種于96孔培養(yǎng)板，24小時后將各濃度梯度的供試品加入96孔板中，同時設不加藥物的細胞對照組，各組設3復孔，加

2、藥4天后分別更換原濃度含藥培養(yǎng)液，加藥8天后于顯微鏡下觀察細胞病變，完全破壞為4；75％破壞為3；50％破壞為2；25％破壞為1；無病變?yōu)?。按Reed-Muench法計算半數有毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。同法將2.2.15細胞接種于24孔培養(yǎng)板，24小時后，以最大無毒濃度為最大上樣濃度，并將最大無毒濃度作2倍或3倍稀釋，共設5個梯度組，同時設不加藥物的細胞對照組，各組設3復孔，加藥4天后收集培養(yǎng)上清液并更換原濃度含藥培

3、養(yǎng)液，加藥8天后收集培養(yǎng)上清液和細胞，將培養(yǎng)4天和培養(yǎng)8天的培養(yǎng)上清液采用放免法(RIA)檢測藥物對表面抗原和e抗原的抑制率，按Reed-Muench法計算半數有效濃度(IC50)，然后計算出樣品在2.2.15細胞培養(yǎng)內對HBsAg和HBeAg的選擇指數(SI)。另將加藥8天后收集的細胞用來提取細胞總DNA，采用斑點雜交法檢測藥物對細胞總DNA的抑制率，按Reed-Muench法計算出半數有效濃度(IC50)，并計算出SI。 采

4、用反相高效液相色譜法對紫紅獐牙菜的全草及不同部位的五種主要有效成分即獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、8-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,5-二羥基-3-甲氧基口山酮、1,5,8-三羥基-3-甲氧基口山酮同時進行含量測定。測定條件為：色譜柱：AlltimaC18色譜柱(250×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.05％磷酸水溶液；梯度洗脫：0min，甲醇20％，50min，甲醇80％，55min，甲醇100％；柱溫：30℃；流速：1.0m

5、l/min；檢測波長：254nm。 結果：石油醚部位、乙醚部位、1,7-二羥基-3,8-二甲氧基口山酮對表面抗原和e抗原均無抑制作用；乙酸乙酯部位中的析出物，濃縮時析出的粉末以及浸膏、水溶性部位上硅膠柱后用氯仿∶甲醇(95∶5)洗脫，第26～39流分、獐牙菜苦苷、齊墩果酸、1,5,8-三羥基-3-甲氧基口山酮對表面抗原有抑制作用，選擇指數(SI)分別為5.2，4.2，12.1、3.55、1.16、14.2、6.8；芒果苷、8-O

6、-β-D-吡喃葡萄糖基-1,5-二羥基-3-甲氧基口山酮、5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,8-二羥基-3-甲氧基口山酮、1,7,8-三羥基-3-甲氧基口山酮以及乙酸乙酯部位中的一種單體成分(未經結構構鑒定)對e抗原有抑制作用，選擇指數(SI)分別為4.5、6.2、6.87、2.36、4.15；而水溶性部位上硅膠柱后用氯仿∶甲醇(95∶5)洗脫，第40～51流分對表面抗原和e抗原均有抑制作用，對表面抗原選擇指數(SI)為5.48，對e抗

7、原選擇指數(SI)為4.32。 對于獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、8-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,5-二羥基-3-甲氧基口山酮、1,5,8-三羥基-3-甲氧基口山酮5種成分紫紅獐牙菜全草分別含：5.57％、不在線性范圍內、0.17％、0.44％、0.62％；根分別含0.56％、0.26％、不在線性范圍內、不在線性范圍內、0.059％；莖分別含2.34％、不在線性范圍內、0.074％、0.17％、0.18％；葉分別含9.30％、

8、不在線性范圍內、0.30％、0.33％、0.64％；分別含11.14％、不在線性范圍內、0.65％、0.73％、1.92％。 結論：紫紅獐牙菜的乙酸乙酯部位對表面抗原有抑制作用。水溶性部位上硅膠柱后用氯仿∶甲醇(95∶5)洗脫，第40～51流分對表面抗原和e抗原有抑制作用，而第26～39流分對表面抗原有抑制作用。獐牙菜苦苷、1,5,8-三羥基-3-甲氧基口山酮、齊墩果酸對HBsAg有效；芒果苷、8-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,

9、5-二羥基-3-甲氧基口山酮、5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,8-二羥基-3-甲氧基口山酮和1,7,8-三羥基-3-甲氧基口山酮對HBeAg有效。 根據含量測定結果可知，龍膽苦苷以根中含量最高，而獐牙菜苦苷、芒果苷、8-O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,5-二羥基-3-甲氧基口山酮、1,5,8-三羥基-3-甲氧基口山酮以花中含量最高、葉中其次、全草再次之，獐牙菜苦苷主要集中在原植物的花中，其含量高達11.14％。本文所建立的方法方