岷江冷杉的化學(xué)成分與體外抗腫瘤活性研究.pdf

1、松科(Pinaceae)冷杉屬(Abies)植物在我國資源豐富、分布廣泛，其中的一些植物有民間藥用的記載。前期研究表明，冷杉屬植物的化學(xué)成分具有多樣性，主要富含萜類成分，這些萜類成分具有結(jié)構(gòu)類型多、取代位置多、手性中心多、重排異構(gòu)多的特點；冷杉屬植物也具有廣泛的生物活性，尤其是具有潛在的抗腫瘤和抗炎活性。岷江冷杉(Abies faxoniana)是我國特有冷杉屬植物，主要分布于四川省和甘肅省，此前尚未有該植物的化學(xué)成分和生物活性研究的相

2、關(guān)報道。本課題以岷江冷杉為對象研究了它的化學(xué)成分與體外抗腫瘤活性。
　　1.化學(xué)成分研究
　　采用多種分離純化技術(shù)和波譜分析方法從岷江冷杉乙醇粗提物的二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位中分離鑒定了101個化合物，其中新化合物41個。這些化合物包括60個三萜類、23個二萜類、8個木脂素類、2個苯丙素類、2個單萜類、1個黃酮類以及5個其它類化合物。
　　在本課題研究中，從岷江冷杉分離鑒定的三萜類化合物主要以羊毛脂烷型為主，包含9對

3、具有螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的三萜化合物(wgw-1/1'–wgw-9/9')，這個特征性的螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)片段的立體構(gòu)型通過 X-ray單晶衍射和核磁方法確定。其中化合物wgw-8/8'由于7(8?9)重排形成一個螺B/C環(huán)(spiro B/C ring)結(jié)構(gòu)。這9對三萜化合物通常都是以互變的混合物形式存在，原因是在23位上的碳螺原子(C-23 spiro carbon)發(fā)生差向異構(gòu)化。我們用HPLC方法證實了差向異構(gòu)體 wgw-1/1'之間，wgw-2

4、/2'之間以及wgw-9/9'之間的相互轉(zhuǎn)化。與wgw-1/1'比較，wgw-9/9'由于側(cè)鏈螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)上 C-24/25雙鍵導(dǎo)致它們之間的轉(zhuǎn)化速度較慢。接下來也通過HPLC測定了這些差向異構(gòu)體之間比例分別為3:1，2:1，3:1，2:1，4.5:1，4.5:1，8:1，10:1，3:2。考慮到溶劑對差向異構(gòu)化的影響，我們通過半制備 HPLC同時獲得兩份wgw-2，并在同樣的時間得到了它們在CDCl3和CD3OD的13C NMR譜。通過

5、比較發(fā)現(xiàn)這兩個13C NMR譜基本相似，說明這兩種溶劑對這類化合物的差向異構(gòu)化影響較小?；衔飛gw-19–wgw-21由于半縮酮γ內(nèi)酯結(jié)構(gòu)(γ-lactone moiety with a hemiketal)上的23位碳原子差向異構(gòu)化也是以不可分離的混合物形式存在，這種類似結(jié)構(gòu)的互變混合物已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)報道?；衔飛gw-26–wgw-30的結(jié)構(gòu)特征在于A環(huán)開環(huán)，此外，化合物 wgw-27還由于8(14?13)重排形成一個螺C/D環(huán)(

6、spiro C/D ring)結(jié)構(gòu)。在化合物結(jié)構(gòu)鑒定方面，除了運用高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)、核磁共振譜(NMR)以及X-ray單晶衍射外，還采用圓二色譜(CD)和PGME法確定化合物的絕對構(gòu)型。以化合物 wgw-11和wgw-45為例，wgw-11的圓二色譜(CD)中216 nm處有一個負(fù)Cotton效應(yīng)，表明wgw-11側(cè)鏈內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)上的C-23為R構(gòu)型，而wgw-45中與羧基相鄰的C-25絕對構(gòu)型可以通過PGME法確定，根據(jù)

7、Δδ=δS–δR可以推斷wgw-45中C-25的絕對構(gòu)型為R。
　　2.體外抗腫瘤活性研究
　　采用MTT法測試了岷江冷杉中分離鑒定的三萜類化合物的腫瘤細(xì)胞毒活性(Huh-7，HepG-2，SMMC-7721，HCT-116，MCF-7，A549)，其中化合物wgw-18抑制 HepG-2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長的IC50值為9.8μM和14.3μM，wgw-6/6'抑制Huh-7肝癌細(xì)胞生長的IC50值為7.5μM

8、。此外，我們也測試了部分三萜類化合物的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制活性，其中wgw-23對拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制活性的IC50值為53.5μM，而拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑依托泊苷的IC50值為49.6μM。
　　接下來以 HepG-2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞為模型，通過以下實驗研究了wgw-18抑制這兩株肝癌細(xì)胞生長的作用機制。1. MTT法檢測了wgw-18在不同濃度、不同時間情況下對HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞生長的影響，并初步確

9、定其有效的抑制濃度。結(jié)果表明 wgw-18能夠濃度–時間依賴性的抑制人肝癌細(xì)胞的生長。2. MTT法測試了wgw-18對正常肝細(xì)胞QSG-7701生長的影響。Hoechst33258染色法檢測了wgw-18對QSG-7701細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)的影響。結(jié)果表明不同濃度的wgw-18孵育24小時后，wgw-18對QSG-7701細(xì)胞生長沒有顯著的抑制作用。3.流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法和Hoechst33258染色法

10、檢測了wgw-18誘導(dǎo)HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀DCFH-DA染色法，Rhodamine123染色法和western blot法檢測了wgw-18對HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS含量，線粒體膜電位MMP和調(diào)亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明wgw-18作用HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞24小時后，線粒體膜電位MMP下降，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，抗凋亡蛋白Bcl

11、-2的表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，cleaved caspase3，cleaved caspase9和cleaved PARP蛋白的表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，wgw-18能夠使HepG-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，并且使Akt蛋白的表達(dá)下調(diào)，但是對SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)ROS含量沒有影響。4.流式細(xì)胞儀和western blot法檢測了wgw-18對HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞生長周期和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的