沙眼衣原體患者血清中存在GPIC噬菌體衣殼蛋白Vp1的抗體.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，C.t)是引起生殖道衣原體感染(Genitalchlamydial infection)的主要病原體占40％～50％。沙眼衣原體感染目前已是西方國(guó)家最常見(jiàn)的性傳播疾病之一，發(fā)病人數(shù)增加很快，已超過(guò)淋病。在我國(guó)，沙眼衣原體感染的患病人數(shù)也在迅速增加。感染者可以有癥狀或無(wú)癥狀，因此診斷常很困難。沙眼衣原體感染可引起男性前列腺炎、附睪炎、直腸炎、女性盆腔炎、不孕癥、異位妊娠等并發(fā)癥，造成

2、嚴(yán)重的后果。同時(shí)由于治療抗生素選擇不當(dāng)、用量小、時(shí)間短等濫用抗生素日趨嚴(yán)重使沙眼衣原體耐藥性問(wèn)題突出，加大了治療的困難。因此，近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者擴(kuò)大了對(duì)沙眼衣原體研究的廣度和深度。其中，針對(duì)衣原體噬菌體的研究得到關(guān)注，噬菌體噬菌體(Phage)是一種感染細(xì)菌的病毒，它能使所寄生的細(xì)菌病變并解體，可被廣泛地用于阻擋和治療感染，在抗生素耐藥日趨嚴(yán)重的情況下，噬菌體抗感染的研究受到了廣泛重視。本課題旨在通過(guò)對(duì)衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白V

3、pl的表達(dá)、鑒定、提純，獲得Vpl蛋白，同時(shí)收集206例沙眼衣原體感染者的血清篩檢出Vpl抗體。明確衣原體感染者衣原體噬菌體的存在，對(duì)于沙眼衣原體感染所致的生殖道衣原體感染的治療預(yù)防等多方面的研究有重要價(jià)值。 目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，獲得衣原體噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vpl蛋白。收集沙眼衣原體感染者的血清，以便篩選出衣原體噬菌體vpl蛋白的抗體，明確噬菌體的存在。促進(jìn)對(duì)沙眼衣原體與噬菌體的進(jìn)一步研究。 方法：挑取帶有原核表

4、達(dá)質(zhì)粒Vpl-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌接種于LB液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，部分純化，離心收集不溶蛋白。按蛋白提純?cè)噭┖姓f(shuō)明進(jìn)行純化，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化后的Vpl蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量分析推算Vpl蛋白濃度。將復(fù)性后的Vpl蛋白免疫小鼠3次后內(nèi)眥靜脈取血收集血清，檢測(cè)免疫后鼠血清Vpl抗體。ELISA篩選含Vpl抗體的血清：包被Vpl蛋白于96孔酶聯(lián)板條中4℃過(guò)夜，PBST洗滌，用含3％BSA的封閉，對(duì)84例正常

5、人和206份C.t感染者血清樣本分別進(jìn)行ELISA測(cè)定OD405，比較二者的檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用Western blot將純化的Vpl蛋白轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上，3％奶粉-TBST液封閉，將免疫小鼠血清、未感染C.t者血清、ELISA陽(yáng)性結(jié)果的血清都以用1％奶粉-TBST稀釋為1：500孵育過(guò)夜，TBST清洗，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人的IgG抗體1：10000孵育，BCIP/NBT顯色后即用水終止反應(yīng)，觀察顏色變化鑒定Vpl抗體。 結(jié)

6、果：帶有原核表達(dá)質(zhì)粒Vpl-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集沉淀蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察在62000處有一比其他雜帶都寬大的條帶，此為Vpl蛋白。提純蛋白后獲得目的條帶，既為純化后的Vpl蛋白。透析復(fù)性提純的目的蛋白，使Vpl蛋白具有抗原性。使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，可得到推算的蛋白濃度，用以免疫小鼠和ELISA測(cè)定。純化后的Vpl蛋白以10/ml包被孔板，將免疫小鼠血清、正常人類血清分別以不同稀釋度進(jìn)行孵育

7、，發(fā)現(xiàn)在1：400稀釋度下陽(yáng)性血清OD405/陰性血清OD405=2.5496，比值差別最大，既此滴度下陰陽(yáng)性血清較差的可能性最小。最終確定以1：400為最適血清稀釋度。待測(cè)血清樣品OD405≥0.102判為陽(yáng)性，反之判為陰性。按此標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定206個(gè)臨床判定為C.t感染者血清OD405，共有18人判為陽(yáng)性，考慮其血清中可能具有Vpl抗體。使用Western對(duì)18例ELISA陽(yáng)性者血清中Vpl蛋白的抗體進(jìn)行明確鑒定，發(fā)現(xiàn)4例血清具有Vpl