SLC38A1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、研究背景:胃癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率在和死亡率一直居高不下。生存率低的主要原因是腫瘤發(fā)現(xiàn)晚及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移所致。因此，提高胃癌生存率的根本途徑是早期診斷和治療。由于發(fā)病機制的復(fù)雜性以及腫瘤的異質(zhì)性等原因，傳統(tǒng)的TNM分期還不能準(zhǔn)確提示和預(yù)知胃癌個體的腫瘤變化信息。所以，從分子水平認識胃癌的發(fā)病機制并尋找一些特征性標(biāo)志物，已成為胃癌診斷、治療的重要途徑。
　　 腫瘤形成(oncogenesis)的過程包括始發(fā)突變

2、、潛伏、促癌和演進。惡性腫瘤的發(fā)生歸根到底是因為原癌基因的激活和抑癌基因的功能喪失。尋找胃癌相關(guān)基因、構(gòu)建其基因表達譜是闡明胃癌的分子發(fā)病機制和進行有效預(yù)防的有效途徑。本實驗室前期應(yīng)用基因芯片研究胃癌和正常胃黏膜基因表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)87個基因表達顯著上調(diào)，140個基因表達顯著下調(diào)，GO分類為12類，涉及腫瘤代謝、粘附、凋亡、細胞周期等促癌機制，部分基因在胃癌中的表達情況及具體機制不詳，值得進一步研究。由于基因芯片有時穩(wěn)定性不佳，如：樣

3、本數(shù)量有限造成一定抽樣誤差，以及統(tǒng)計學(xué)處理方法不同，可能導(dǎo)致結(jié)果差別很大等。因此，要篩選出有價值的基因還需要經(jīng)過多種方法的驗證。為了進一步從中篩選出有診斷判斷價值的基因，我們從基因芯片結(jié)果中選取了8個表達差異明顯的基因進行了初步驗證。通過Real-time PCR分析檢測，有7個基因的表達改變情況與芯片結(jié)果一致。結(jié)合查閱文獻及通過Western blot驗證，我們發(fā)現(xiàn)了一個在胃癌組織中顯著高表達的有價值基因，即SLC38A1基因。

4、>　　 SLC38A1基因?qū)儆诎被徂D(zhuǎn)運載體家族，近來有研究發(fā)現(xiàn)某些氨基酸轉(zhuǎn)運載體與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如食管癌、口腔鱗狀細胞癌、結(jié)直腸腺癌、肝癌等，在胃癌中的研究未見報道。該家族基因的作用機制尚不明確，有學(xué)者推測可能是因其提供給細胞快速增殖所需要的必需氨基酸，從而導(dǎo)致腫瘤細胞快速生長。例如，美國猶他大學(xué)研究人員在一份2009年《美國科學(xué)院院報》的研究報道中指出：體內(nèi)谷氨酰胺對腫瘤細胞吸收葡萄糖十分關(guān)鍵。假如沒有谷氨酰胺，腫瘤細胞

5、就會因為無法吸收葡萄糖而出現(xiàn)“短路”，從而無法正常生長，即使只是限制谷氨酰胺的含量水平，也能抑制腫瘤細胞的生長。而SLC38A1所屬的A型氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)正是負責(zé)轉(zhuǎn)運谷氨酰胺的重要轉(zhuǎn)運體，其轉(zhuǎn)運的其他氨基酸如丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸等也有報道證實與腫瘤相關(guān)。因此，是否由氨基酸轉(zhuǎn)運體的異常表達導(dǎo)致了體內(nèi)氨基酸水平異常變化并促進了腫瘤發(fā)生發(fā)展，值得進一步研究。若能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤的營養(yǎng)供給的根源并給予切斷，這一理念也符合“餓死”腫瘤細胞的治療方法，為

6、癌癥治療提供了新思路。
　　 目的:研究SLC38A1蛋白在中國胃癌人群中的表達情況及其臨床意義，并探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。為進一步明確胃癌發(fā)生發(fā)展過程中分子作用機理，以及尋找胃癌生物治療新的作用靶點提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、前期應(yīng)用人類全基因組芯片篩選出一組胃癌及癌旁正常組織中差異表達基因，應(yīng)用Real-time PCR進行初步驗證，結(jié)合文獻選擇SLC38A1為目的基因，采用West

7、ernblot繼續(xù)驗證該基因在人胃癌細胞系、新鮮胃癌組織樣本中的表達。
　　 2、構(gòu)建含1072例胃癌及癌旁正常組織的組織芯片，用免疫組織化學(xué)方法觀察胃癌與正常組織中SLC38A1的表達情況；并應(yīng)用SPSS13統(tǒng)計學(xué)方法分析該基因與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 3、構(gòu)建SLC38A1基因shRNA表達載體，轉(zhuǎn)染SLC38A1高表達細胞株SH-10-TC，觀察沉默效率；采用細胞增殖分析、遷移實驗、侵襲實驗、凋亡實驗等體外方

8、法，比較干擾組si-SLC38A1與陰性對照組si-Ctl的增殖、遷移、侵襲能力及細胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 1、基因芯片雜交篩選發(fā)現(xiàn)一組胃癌及癌旁正常組織中差異表達基因，采用Real-time PCR初步驗證芯片結(jié)果可靠。結(jié)合芯片結(jié)果及文獻，選取SLC38A1為目的基因，Western blot檢測20對胃癌及癌旁正常組織標(biāo)本提示該基因主要在胃癌中表達，在8種常見胃癌細胞系中都有高水平SLC38A1蛋白表達，且以S

9、H-10-TC細胞系最高。
　　 2、成功構(gòu)建21張胃癌組織芯片，癌組織中SLC38A1染色胞漿陽性細胞呈片狀和/或彌漫分布，癌旁組織中陽性細胞呈散在或片狀分布，且染色強度均弱于癌組織。統(tǒng)計結(jié)果表明，癌組織SLC38A1的表達率高于癌旁正常組織(P＜0.05)。
　　 3、SLC38A1蛋白的表達水平與年齡(＞60years；P=0.004)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)、臨床分期(P＜0.001)、分化(P＜0.001

10、)和PCNA表達(P=0.002)均有關(guān)。
　　 4、成功構(gòu)建SLC38A1基因shRNA表達載體，轉(zhuǎn)染SH-10-TC細胞系后觀察CCK-8、Migration實驗提示：SLC38A1基因沉默后細胞株較高表達SLC38A1者的增殖、遷移能力均下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、SLC38A1在常見胃癌細胞系中不同程度高表達，在胃癌組織中的mRNA及蛋白表達水平均高于癌旁正常胃黏膜組織，為進一步尋找新

11、的分子標(biāo)志物提供依據(jù)。
　　 2、組織芯片結(jié)果顯示SLC38A1主要在胃癌中表達，提示該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，有可能成為腫瘤治療的良好預(yù)測靶點。
　　 3、本研究將SH-10-TC細胞內(nèi)源性高表達的SLC38A1基因沉默后作了詳細細胞功能學(xué)研究，結(jié)果表明降低SLC38A1表達后能夠使得腫瘤細胞增殖、遷移能力下降。提示SLC38A1可能通過促進腫瘤增殖、遷移能力參與了胃癌發(fā)生、發(fā)展過程。該實驗為進一步發(fā)掘新的靶點提