胃癌發(fā)生發(fā)展中Synbindin的作用及其機(jī)制和意義.pdf

1、目的:胃癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素、多步驟的病理過程，是各種原因?qū)е露嗷蛲蛔兝鄯e和相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果。大多數(shù)胃癌是由其癌前疾病(最主要是慢性萎縮性胃炎)發(fā)展而來。近年來研究發(fā)現(xiàn)胃癌中存在ERK/MAPK通路的異?；罨芯縀RK/MAPK通路活化的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)胃癌的早期干預(yù)與臨床治療靶點(diǎn)，挑選合適的胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后預(yù)測(cè)因子具有重要意義和價(jià)值。先前我們以ERK2為餌通過酵母雙雜交首次發(fā)現(xiàn)Synbindin可與ERK2直

2、接結(jié)合，并通過Co-IP和GSTpull-down試驗(yàn)證實(shí)了兩者的相互作用。在此我們假設(shè)Synbindin是ERK/MAPK通路活化的潛在調(diào)控分子之一，試圖從胃癌患者臨床標(biāo)本、體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)等多個(gè)角度研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用與內(nèi)在機(jī)制。
　　方法:我們通過免疫熒光雙染明確在不同生理病理階段組織標(biāo)本中Synbindin與ERK2的表達(dá)情況，以及Synbindin表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征間的關(guān)系;在胃癌

3、細(xì)胞中我們首先過表達(dá)Synbindin后通過基因表達(dá)譜芯片明確其下游基因及其與ERK/MAPK通路的關(guān)系，并通過RNA干擾的方式檢測(cè)降低Synbindin表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞周期、凋亡、增殖、侵襲等功能的影響，以及對(duì)MAPK通路中主要蛋白(MEK1、ERK2)的磷酸化修飾和總體水平的影響;在裸鼠中我們給予皮下注射胃癌細(xì)胞構(gòu)建移植瘤模型，然后通過瘤內(nèi)多點(diǎn)注射Synbindin小干擾RNA了解其在體內(nèi)水平對(duì)于移植瘤生長(zhǎng)的影響;接著我們采用生物信

4、息學(xué)方法預(yù)測(cè)Synbindin與ERK2發(fā)生相互作用的位點(diǎn)，構(gòu)建結(jié)構(gòu)域缺失克隆后通過免疫熒光和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)明確Synbindin結(jié)合ERK2的結(jié)構(gòu)域以及其調(diào)控ERK2活性的分子機(jī)制;最后我們通過預(yù)測(cè)并分析Synbindin啟動(dòng)子序列，結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等方法證實(shí)上游基因?qū)ynbindin的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)在正常胃黏膜-慢性萎縮性胃炎伴腸化-胃癌黏膜組織中，Synbindin表達(dá)水

5、平隨著病理情況加重而逐漸升高(P＜0.0001)，且ERK2的活化及入核水平與Synbindin表達(dá)程度呈正相關(guān)(P＜0.0001);此外結(jié)合胃癌患者臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)Synbindin表達(dá)水平與腫瘤體積、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、鮑曼分級(jí)、腫瘤累及2/3以上淋巴結(jié)組比率以及臨床分級(jí)等因素呈明顯正相關(guān)(P值均小于0.01)。通過高通量芯片篩選我們發(fā)現(xiàn)Synbindin下游基因中相當(dāng)一部分與ERK/MAPK密切相關(guān)，且敲低Synbindin后磷酸化ER

6、K2表達(dá)量明顯下降，而磷酸化MEK1、總體MEK1和ERK2水平均未出現(xiàn)明顯變化;下調(diào)Synbindin表達(dá)可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯、凋亡增加、增殖抑制和侵襲能力下降，過表達(dá)Synbindin可賦予人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1侵襲能力，并伴隨有P21WAF、cyclinB1、cleaved-PARP、Bax、bcl2、survivin、E-cadherin等基因的變化，且Synbindin發(fā)揮原癌基因功能部分依賴于ERK2;裸鼠

7、試驗(yàn)中體內(nèi)敲低Synbindin可明顯抑制移植瘤生長(zhǎng)，免疫組化分析提示SiRNA干預(yù)組標(biāo)本中Synbindin及磷酸化ERK2活化及入核水平均低于對(duì)照組;免疫熒光及FRET提示Synbindin通過在高爾基體上同時(shí)招募MEK1從而調(diào)節(jié)ERK2的活化及入核，且它與ERK2通過其LDc結(jié)構(gòu)域結(jié)合，LDc結(jié)構(gòu)域缺失可影響Synbindin的功能;通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提示NF-κB可與Synbindin啟動(dòng)子DNA結(jié)合，采用IMD-0354可抑制

8、Synbindin基因表達(dá)及啟動(dòng)子活性，ChIP進(jìn)一步證實(shí)NF-κB家族主要成員之一p50可直接結(jié)合在Synbindin啟動(dòng)子上，而另一家族成員p65則未發(fā)現(xiàn)與Synbindin啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　結(jié)論:我們的研究提示Synbindin可作為影響胃癌發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因子，在體內(nèi)組織學(xué)水平和體外細(xì)胞學(xué)水平調(diào)節(jié)胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等情況，從而影響胃癌患者的預(yù)后，且其功能的發(fā)揮部分依賴于對(duì)ERK2活性的調(diào)節(jié);Synbindin作為潛在的E