異種肌腱基質(zhì)材料的生物相容性研究.pdf

1、研究背景：
　　 臨床上因各種因為所造成的軟組織缺損的修復是整形修復外科面對的主要問題之一。軟組織的缺損畸形不僅嚴重影響患者功能和外觀,而且影響其心理健康和生活質(zhì)量。各種充填材料的應用是修復畸形缺損的有效手段之一,但目前臨床常用的材料都不同程度地存在一些問題而不能完全滿足臨床治療的要求。近年來,組織工程與再生醫(yī)學發(fā)展迅速,特別是再生醫(yī)學理論為理想的軟組織材料研究指明了前景。再生醫(yī)學是研究組織器官缺損生理性修復以及功能重建的新興學

2、科,其重要的技術方法即是采用人工生物組織移植并通過激活局部干細胞、改變局部微環(huán)境來誘導組織再生和替代,從而達到生理性修復。異種基質(zhì)材料因其結構與人體組織相似,與細胞親和性強,能為細胞分化、增殖、生長及功能發(fā)揮提供近似體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細胞外基質(zhì)(ECM)支架條件,加之其來源豐富,故逐漸被應用到再生醫(yī)學領域。采用各種脫細胞技術處理的異種基質(zhì)材料,如膀胱、輸尿管、骨組織、心瓣膜、硬腦膜以及脫細胞真皮等,部分已進入臨床試驗階段,但在整形外科領

3、域,除針對皮膚組織缺損的脫細胞真皮材料基質(zhì)(AlloDerm)外,目前還鮮有其它異種軟組織材料的應用研究報道。
　　 異種材料在制作過程中需進行交聯(lián)處理,以解決生物來源材料的病菌傳播問題,并增強其力學強度,增進其生物穩(wěn)定性并最終解決生物來源材料的儲存問題。同時,通過交聯(lián)處理保持了生物材料的天然結構,使有利于材料與其植入的生物體融合。戊二醛為目前應用最廣泛的交聯(lián)劑,雖然能起到組織固定及去抗原雙重功能,但也存在去除抗原不徹底,特別是

4、固定的組織降解物存在醛類,在組織處理過程中引入了殘留毒性,這不利于細胞增殖、分化、遷徙以及功能建立。另外,還會引起宿主一定的體液及細胞免疫排斥反應,而且,用戊二醛進行化學交聯(lián)后材料容易變得僵硬,柔韌性下降,在醫(yī)用時常引起嚴重的鈣化。“再生型醫(yī)用植入器械國家工程實驗室”(廣東冠昊生物科技股份有限公司承擔)采用一種高反應活性的環(huán)氧化物作為交聯(lián)劑(專利號:US6106555、US6231614B1)解決了這一難題,研究證實此種環(huán)氧化物可與蛋白

5、質(zhì)分子形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵,大大提高材料的穩(wěn)定性,且無殘留毒性,使被處理的異種材料不僅穩(wěn)定性好,不引起免疫排異反應,還能誘導機體組織向其中生長,并和機體組織融為一體。采用此環(huán)氧化物交聯(lián)處理研制的異利-腦膜材料已獲得SFDA認證,并在臨床廣泛應用。以豬的肌腱為原料,采用同一種環(huán)氧化物作為交聯(lián)劑,應用組織固定、去抗原等系列專利技術,“再生型醫(yī)用植入器械國家工程實驗室”研制出了新型異種肌腱基質(zhì)材料(xenogenic tendon matrix

6、materials,XTMM)。本研究擬通過光鏡、掃描電鏡觀察XTMM的超微結構,參照醫(yī)用植入材料的國家標準對XTMM的拉伸強度、扯斷伸長率、蛋白含量、及重金屬和環(huán)氧化物殘留量進行研究,評價材料的理化性能,進一步通過急件全身毒性試驗、致敏試驗、皮內(nèi)刺激試驗、細胞毒性試驗和皮下埋植試驗研究其安全性、生物相容性和生物學轉(zhuǎn)歸,探討XTMM的生物學性能和應用機制,為異種基質(zhì)材料的研究和應用奠定基礎。
　　 研究方法
　　 一、X

7、TMM的制備
　　 取新鮮豬肌腱,消毒后首先作預處理,脫細胞處理后環(huán)氧交聯(lián)固定,加上采用自主研發(fā)的系列專利技術,包括多方位除抗原技術,蛋白質(zhì)分子修飾技術等,作進一步處理后,裁剪、成形、包裝,鈷60照射滅菌,備用。
　　 二、XTMM的形態(tài)學觀察
　　 制備的XTMM分別行大體觀察、常規(guī)HE染色后光鏡下觀察材料的超微結構以及掃描電鏡觀察材料的微觀結構。掃描電鏡觀察:取材料的切片,2.5％(V/V)戊二醛4℃固定24

8、 h,經(jīng)30％-100％梯度乙醇脫水、醋酸異戊酯浸泡30 min、等電點干燥。干燥后的樣品表面噴鉑金,掃描電鏡觀察XTMM的微觀結構。
　　 三、XTMM的理化性能檢測
　　 使用微控電子式拉力試驗機測量該材料的拉伸強度和拉斷伸長率等；采用凱氏定氮法粗略測量材料的總蛋白含量;測量材料的重金屬含量和環(huán)氧化物殘留量；通過測量材料在PBS溶液中的PH值,繪制時間-pH圖像,研究材料的化學穩(wěn)定性。
　　 四、XTMM的生

9、物相容性研究
　　 參照醫(yī)療器械生物學評價標準和要求,采用標準的毒理學方法進行急性毒性試驗、致敏試驗、皮內(nèi)刺激實驗、細胞毒性試驗和皮下埋植試驗,對制備的XTMM進行系統(tǒng)的生物相容性及生物安全性評價。
　　 五、XTMM的長期轉(zhuǎn)歸的實驗研究
　　 選用健康成年雜種犬24只,雌雄不限,體重10-13公斤,按實驗后取材時間不同隨機分為4組,每組6只,將材料埋置于狗的鼻骨骨膜下,以目前臨床最常用的隆鼻材料硅膠作為對照,3

10、、6、9、12月定期取材,處死動物后取材,H&E染色,光鏡下研究XTMM的生物學轉(zhuǎn)歸。
　　 六、統(tǒng)計方法
　　 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,材料的理化性能檢測采用單樣本t檢驗,皮下埋植試驗采用兩相關樣本非參數(shù)檢驗,P值<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 一、XTMM的形態(tài)學觀察
　　 材料成均勻的乳白色或淺黃色,表面隱約可見條紋狀天然結構,質(zhì)地均

11、一,材料柔韌性尚可,易塑形,易縫合,可按照所需的大小剪裁。HE染色光鏡下見材料為紅染纖維束樣物,可見縫隙,未見細胞碎屑及藍染的核物質(zhì),脫細胞完全。掃描電鏡觀察結果見走向一致的發(fā)狀纖維樣物緊密縱行平行排列,平直,無明顯彎曲,分叉不明顯,表面可見棉絮樣物附著,未見細胞成份。
　　 二、XTMM的理化性能檢測
　　 材料的拉伸強度為11-16 MPa,拉斷伸長率為52-67％,均高于標準要求。粗測XTMM總蛋白含量為94％,證

12、明材料組成較為單一。重金屬含量結果小于1ug/ml,符合不得高于1 ug/ml的標準要求；環(huán)氧化物的殘留量檢測結果為5ug/ml,完全達到應小于10 ug/ml的標準規(guī)定。材料化學穩(wěn)定性檢測24h pH值連續(xù)監(jiān)測顯示,XTMM在PBS溶液中的pH值穩(wěn)定,pH值為7.25-7.32。
　　 三、XTMM的生物相容性研究
　　 急性毒性實驗:各組小鼠活動正常,72 h小鼠無死亡,各組動物未見中毒癥狀或不良反應。致敏試驗顯示材

13、料組和陰性對照組的皮膚反應指數(shù)均為0,無致敏性。皮內(nèi)刺激實驗觀察顯示,材料浸提液和生理鹽水處無明顯紅斑、水腫和皮膚壞死,極輕微刺激。材料的細胞毒性結果示該材料的相對增殖度較高,細胞毒性分級在0-1級。皮下埋植試驗顯示各組動物術后生存良好,植入部位均未見組織壞死、積液及化膿感染。組織學觀察顯示材料在植入14天時引起輕到中度炎癥反應,但隨時間延長炎癥反應逐漸消失。術后不同時間點植入材料組與對照組組織學評分比較差異無顯著性意義(P>0.05)

14、。
　　 四、XTMM的長期轉(zhuǎn)歸的動物實驗研究
　　 XTMM按預期的設計顯示了植入后的轉(zhuǎn)歸,材料內(nèi)部可見自體新生纖維結締組織呈“蟹足樣”長入,形成由原植入物和新生自體組織交織在一起的“過渡態(tài)結構”。呈現(xiàn)新生組織逐漸增加,最終取代殘留植入材料的趨勢。經(jīng)歷1年的緩慢降解,植入的材料殘留部分仍然保持了比較完整的微觀結構,并與周圍新生的纖維組織交織在一起。
　　 結論
　　 本研究制備的XTMM脫細胞完全,未見