牛肌腱膠原的提取及生物相容性的研究.pdf

1、目的： 1、建立一種牛肌腱高效提取膠原蛋白的方法并對(duì)提取的膠原蛋白的生物學(xué)性能進(jìn)行表征檢測(cè)。 2、觀察牛肌腱膠原蛋白和鼠尾膠原蛋白構(gòu)建的組織工程皮膚收縮情況。 3、研究不同類型膠原蛋白對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞粘附的影響，并用原子力顯微鏡觀察膠原與種子細(xì)胞粘附的微觀結(jié)構(gòu)。 4、利用天狼猩紅偏振光法檢測(cè)復(fù)方殼多糖組織工程皮膚中膠原合成與分泌情況。 方法 1、建立了以酸酶聯(lián)合提取牛肌腱膠原蛋白的方法，并對(duì)

2、提取的牛肌腱膠原進(jìn)行氨基酸含量、熱變性溫度、紅外光譜及其它的一些生物學(xué)性能檢測(cè)。 2、新鮮清潔兒童包皮，用酶消化后分離培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，用我科已建立的方法，分別采用牛肌腱膠原蛋白和鼠尾膠原蛋白構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程皮膚，觀察不同類型膠原蛋白構(gòu)建的組織工程皮膚的收縮情況，繪制收縮曲線。 3、分別用牛肌腱膠原、鼠尾膠原和標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ型膠原包被培養(yǎng)板，接種相同數(shù)量的原代角質(zhì)細(xì)胞，在不同時(shí)相用活細(xì)胞電子計(jì)數(shù)儀測(cè)定未粘附細(xì)胞

3、的數(shù)量，觀察不同類型膠原所未粘附的細(xì)胞數(shù)量的多少，繪制細(xì)胞粘附曲線，并用原子力顯微鏡觀察膠原蛋白與細(xì)胞的粘附情況。 4、用我科已建立的方法，制備復(fù)方殼多糖組織工程皮膚，然后采用苦味酸一天狼星紅染色，用偏振光顯微鏡觀察，Photoshop半定量分析制備的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚中Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成和分泌情況。 結(jié)果 1、以牛肌腱為原料，用醋酸及水果蛋白酶的方法，可以高效率的提取膠原蛋白，經(jīng)測(cè)定提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原

4、蛋白。 2、用牛肌腱膠原構(gòu)建的組織工程皮膚其收縮度比相同濃度的鼠尾膠原構(gòu)建的組織工程皮膚其收縮度小(P<0.05)。 3、接種1小時(shí)以內(nèi)，Ⅳ型膠原對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附特性強(qiáng)于牛肌腱膠原和鼠尾膠原，1小時(shí)以后，三者粘附差別不明顯，牛肌腱膠原和鼠尾膠原亦無(wú)明顯差異。 4、原子力顯微鏡可以清晰的觀察到膠原及膠原與細(xì)胞間粘附的微觀結(jié)構(gòu)。 5、正常皮膚和復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的真皮中都有Ⅰ、Ⅲ膠原，在正常皮膚的真皮

5、中Ⅰ、Ⅲ膠原含量分別是98.51±11.28、33.93±3.90；培養(yǎng)成熟的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚中Ⅰ、Ⅲ膠原含量分別是91.42±3.82、30.75±2.29，兩者相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。復(fù)方殼多糖組織工程皮膚培養(yǎng)8天、15天、30天，組織內(nèi)Ⅰ型膠原分別為50.75±4.22、63.57±6.87、91.42±3.82，Ⅲ型膠原分別為16.90±1.64、23.65±4.08、30.75±2.29，組間比較有顯著差異(P<

6、0.01)。 結(jié)論 1、酸酶相結(jié)合的方法可以高效率的從牛肌腱中提取膠原蛋白，用提取的牛肌腱膠原構(gòu)建的組織工程皮膚其收縮度比鼠尾膠原構(gòu)建的組織工程皮膚收縮度小，說(shuō)明用牛肌腱膠原蛋白能顯著降低組織工程皮膚的收縮度，證明組織工程皮膚制造選擇牛肌腱膠原較好，能夠提高產(chǎn)品的性能。 2、牛肌腱膠原和鼠尾膠原與Ⅳ型膠原對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附作用無(wú)明顯差別，用原子力顯微鏡可以觀察到膠原及膠原與細(xì)胞間粘附的微觀結(jié)構(gòu)。 3、培