環(huán)孢素A動(dòng)脈灌注局部免疫抑制在大鼠異體后肢移植中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分大鼠股動(dòng)脈灌注局部免疫抑制模型的建立
　　 背景：
　　 高血藥濃度伴隨的毒副作用是困擾移植研究的難題，而移植物組織內(nèi)的藥物濃度又是延長(zhǎng)其存活的關(guān)鍵因素。腫瘤學(xué)的經(jīng)驗(yàn)證明，局部用藥是降低全身血藥濃度、提高靶向組織藥物利用率的一條可行出路。多種免疫抑制劑已被證明可通過(guò)動(dòng)脈直接灌注的方式成倍提高移植物內(nèi)的藥物濃度。但既往研究所用藥物老舊，且由于缺乏有效的藥物緩釋工具，無(wú)法對(duì)免疫抑制劑的長(zhǎng)期動(dòng)脈灌注進(jìn)行跟蹤觀察。隨著環(huán)

2、孢素等強(qiáng)效免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，以及各種新型藥物緩釋工具的推廣，使得動(dòng)脈內(nèi)長(zhǎng)期藥物灌注成為可能。
　　 目的;
　　 通過(guò)構(gòu)建大鼠肢體再植模型，模擬異體移植的血運(yùn)狀態(tài)，分析環(huán)孢素A動(dòng)脈灌注的藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，探討局部動(dòng)脈灌注長(zhǎng)期免疫抑制的可行性。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠60只，體重300～350g。大鼠隨機(jī)等分為“口服灌胃組”、“腹腔注射組”、“靜脈灌注

3、組”和“動(dòng)脈灌注組”。每組分別下設(shè)3個(gè)亞組，每亞組5只，分別對(duì)應(yīng)2.5mg·kg-1·day-1、5.0mg·kg-1·day-1、10mg·kg-1·day-1三種不同等級(jí)的環(huán)孢素給藥劑量。
　　 2.肢體再植模型
　　 所有受試大鼠于右后肢橫行截肢后原位再植，于右股骨中段離斷所有血管神經(jīng)束和大腿肌群，鋸斷股骨。隨后以18G不銹鋼針頭對(duì)股骨行原位髓內(nèi)固定。以標(biāo)準(zhǔn)顯微外科技術(shù)吻合股動(dòng)靜脈和坐骨神經(jīng)。絲線間斷縫合肌肉和皮膚

4、
　　 3.環(huán)孢素A干預(yù)
　　 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予環(huán)孢素A持續(xù)免疫抑制60天?？诜辔附M和腹腔注射組每日予環(huán)孢素間斷給藥一次。靜脈灌注組和動(dòng)脈灌注組大鼠背部皮下埋置灌注專用Smith受藥接頭，并行再植肢體（右側(cè)）股動(dòng)靜脈插管，以微量泵每日持續(xù)灌注等量藥物。各亞組分別給予環(huán)孢素2.5、5.0、10mg·kg-1·day-1。血管內(nèi)藥物投放采用“環(huán)孢素保存液+低分子右旋糖酐抗凝稀釋液”的分段式雙通道預(yù)混合灌注模式，避免藥物曠置

5、分解及血栓等并發(fā)癥。
　　 4.環(huán)孢素血藥濃度檢測(cè)
　　 觀察到期后采集大鼠胸主動(dòng)脈全血樣本，以酶放大免疫法測(cè)定外周血環(huán)孢素藥物濃度，比較不同給藥途徑所得的全身血藥濃度，及不同給藥方式的血藥濃度的轉(zhuǎn)化率。
　　 5.再植肢體環(huán)孢素組織濃度檢測(cè)
　　 60天末取再植肢體皮膚與肌肉標(biāo)本，經(jīng)組織碎化處理后制備勻漿液，以酶放大免疫法測(cè)定組織內(nèi)環(huán)孢素藥物濃度。分析動(dòng)脈灌注環(huán)孢素的局部藥物濃度優(yōu)勢(shì)。
　　 6

6、.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，經(jīng)SPSS13.0軟件采用單向方差分析（ANOVA）和析因方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，比較不同給藥途徑對(duì)環(huán)孢素全身血藥濃度的影響，分析不同給藥途徑對(duì)于提高組織內(nèi)藥物濃度的效率。
　　 結(jié)果:
　　 1.大體觀察
　　 腹腔注射組有40％（5例中的2例）大鼠因長(zhǎng)期反復(fù)注射出現(xiàn)腹腔感染，靜脈灌注組中有2例懷疑死于高濃度環(huán)孢素蓄積導(dǎo)致的藥物毒性?？诜辔附M和動(dòng)脈灌注

7、組大鼠耐受良好。動(dòng)脈灌注組未發(fā)生感染、血栓等并發(fā)癥。
　　 2.血藥濃度比較
　　 動(dòng)脈直接灌注環(huán)孢素使得血藥濃度較靜脈用藥降低28％～40％（P＜0.05）。給予低劑量(2.5mg·kg-1·day-1)環(huán)孢素時(shí)，動(dòng)脈灌注組血藥濃度略高于口服組和腹腔注射組。灌注“中等～高”劑量(5～10mg·kg-1·day-1)環(huán)孢素時(shí)，所得全身血藥濃度與口服和腹腔注射相當(dāng)。口服環(huán)孢素A的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率約為23％～52％，隨劑量增大吸

8、收率逐漸提高，顯示胃腸道對(duì)環(huán)孢素的首關(guān)消除作用有飽和現(xiàn)象。腹腔注射環(huán)孢素轉(zhuǎn)化率為43％～69％，中等劑量下（5mg·kg-1·day-1）利用率最高。動(dòng)脈灌注環(huán)孢素利用率較為恒定，為60％～72％。
　　 3.再植肢體組織內(nèi)環(huán)孢素濃度比較
　　 動(dòng)脈灌注組皮膚組織環(huán)孢素濃度為等劑量口服組的4.6～25.9倍，腹腔組的4.1～14.5倍，靜脈組2.4～5.1倍。肌肉內(nèi)藥物濃度分別為等劑量口服組3.2～12倍，腹腔組3.3～

9、7.9倍，靜脈組的1.7～3.3倍。
　　 結(jié)論:
　　 局部動(dòng)脈灌注環(huán)孢素與全身用藥相比，能有效降低全身血藥濃度，成倍提高目標(biāo)組織內(nèi)的藥物在濃度。單一肢體的長(zhǎng)期動(dòng)脈灌注模型穩(wěn)定可靠。
　　 第二部分環(huán)孢素A局部動(dòng)脈灌注在大鼠肢體移植中的應(yīng)用
　　 背景:
　　 已有多種藥物被證明可通過(guò)局部動(dòng)脈灌注促進(jìn)移植物的存活。但既往研究所用藥物因效能不佳均已淘汰。環(huán)孢素臨床應(yīng)用成熟，且已被已被證明可通過(guò)局部

10、外用發(fā)揮免疫抑制作用。藥物動(dòng)力學(xué)研究顯示環(huán)孢素動(dòng)脈直接灌注可進(jìn)一步提高其在移植物中的分布，但其實(shí)際抗排斥效果，尤其是長(zhǎng)期灌注的效能尚未得到驗(yàn)證。
　　 目的:
　　 通過(guò)構(gòu)建大鼠后肢異體移植模型，研究動(dòng)脈直接灌注環(huán)孢素A對(duì)移植物存活的影響，探討動(dòng)脈灌注局部免疫抑制的可行性，分析長(zhǎng)期動(dòng)脈灌注下環(huán)孢素在內(nèi)臟的蓄積作用，為局部免疫抑制的臨床應(yīng)用積累理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.大鼠異體后肢移植模型構(gòu)建

11、r>　　 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)顯微血管外科技術(shù)構(gòu)建異種大鼠后肢再植模型。選取近交系棕色BrownNorway大鼠(BN;RT1n)和白色Lewis大鼠(LEW;RT11)分別作為后肢的供體和受體。受體大鼠術(shù)前一天給予兔抗大鼠淋巴細(xì)胞血清1.0ml+環(huán)孢素10mg·kg-1·day-1腹腔注射一次進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。于供體BN大鼠右股骨中段橫行截肢，離斷所有股血管神經(jīng)束及股骨。受體LEW大鼠同等平面截肢，以顯微血管外科技術(shù)“端—端”吻合供受體股動(dòng)靜脈和坐

12、骨神經(jīng)。股骨斷端以18G髓內(nèi)釘固定。肌肉、皮膚行間斷縫合。另取Lew大鼠以同法截肢后原位再植作為同系移植對(duì)照。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　 受體Lewis大鼠5只接受自體后肢再植作為同系移植對(duì)照組(Iso)。單純異體移植組(Allo)5只，僅行異體后肢移植而不接受免疫抑制療程，作為對(duì)照。另選異體移植大鼠（54只）接受環(huán)孢素A持續(xù)免疫抑制，并按給藥途徑隨機(jī)分成腹腔注射組(I.P.)、靜脈灌注組(I.V.)和動(dòng)脈灌注組(I

13、.A.)。各組下設(shè)3個(gè)亞組，分別給予2.5、5.0、10mg·kg-1·day-1三種劑量的環(huán)孢素。腹腔注射組每日予腹腔藥物注射一次，動(dòng)脈灌注組和靜脈灌注組行股動(dòng)靜脈置管，每日予等量藥物以微量泵行連續(xù)血管內(nèi)灌注。
　　 3.長(zhǎng)期灌注模型的實(shí)現(xiàn)
　　 動(dòng)脈和靜脈灌注組大鼠接受肢體移植后，采用“體內(nèi)段+體外段”的分段式灌注管路，構(gòu)建長(zhǎng)期血管灌注通道。體內(nèi)段包含大鼠背部皮下埋置專用受藥接頭泵，連接聚氨酯抗凝導(dǎo)管植入大鼠移植肢體

14、股動(dòng)靜脈。體外段管路以微量泵經(jīng)特殊皮外接頭注入皮下受藥接頭，與體內(nèi)段實(shí)現(xiàn)連接。體內(nèi)段長(zhǎng)期封閉于皮下，避免長(zhǎng)期留置引起的感染。體外段便于拆卸、更換及定期消毒。免疫抑制劑藥液采用“環(huán)孢素保存液+肝素化低分子右旋糖抗凝稀釋液”雙通道預(yù)混合方式輸注。藥物以原液形式保存，與稀釋液在三通管內(nèi)即時(shí)混合后注入血管，避免藥液長(zhǎng)期曠置引起的分解及毒性增高?？鼓♂屢翰捎门R床封管液材料，最大限度降低導(dǎo)管血栓機(jī)率。
　　 4.生存期觀察
　　

15、每日記錄移植物存活情況，出現(xiàn)不可逆性嚴(yán)重排斥反應(yīng)（臨床評(píng)分3級(jí)以上）或肢體存活超過(guò)100天作為觀察終點(diǎn)。對(duì)比不同給藥途徑和不同環(huán)孢素劑量下移植物的存活期差異。
　　 5.移植物組織學(xué)比較
　　 觀察中止后對(duì)移植物行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。行蘇木精—依紅染色，并行組織病理學(xué)觀察，比較不同給藥途徑下的排斥反應(yīng)特點(diǎn)。
　　 6.移植物排斥度病理評(píng)分對(duì)肢體長(zhǎng)期存活的個(gè)體，取移植物前、后、內(nèi)、外四處皮膚組織，按Banff

16、2007復(fù)合組織移植物病理評(píng)分，計(jì)算移植物平均排斥度。比較不同給藥途徑對(duì)移植物排斥程度的影響。
　　 7.內(nèi)臟藥物蓄積比較
　　 對(duì)移植物長(zhǎng)期存活的大鼠，切取其肝臟和右側(cè)腎臟，經(jīng)碎化處理后制備組織勻漿，以酶放大免疫法檢測(cè)組織內(nèi)環(huán)孢素藥物濃度，評(píng)價(jià)長(zhǎng)期灌注后內(nèi)臟藥物蓄積情況。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS13.0軟件采用單向方差分析(ANOVA)和析因方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，排斥度等級(jí)資料采

17、用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.大體觀察
　　 自體再植對(duì)照組大鼠無(wú)任何排斥跡象。單純移植組大鼠無(wú)一例外出現(xiàn)嚴(yán)重排斥反應(yīng)，移植物出現(xiàn)進(jìn)行性紅斑、皮疹、脫毛、肢體腫脹，直至最終肢體壞死脫落。各環(huán)孢索干預(yù)組中未達(dá)長(zhǎng)期存活個(gè)體，最終肢體反應(yīng)與單純移植組類似。環(huán)孢素劑量為2.5mg·kg-1·day-1時(shí)，動(dòng)脈灌注組以肢體腫脹為主的體液免疫表現(xiàn)較為明顯，而局部皮膚損害較全身用藥組略輕。大劑量環(huán)孢素治療時(shí)，腹腔

18、注射組2例出現(xiàn)反復(fù)注射引起的腹腔感染。靜脈組部分大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神差等藥物毒性反應(yīng)。其中兩例大鼠懷疑因不耐受大劑量藥物的長(zhǎng)期蓄積而死亡。腹腔注射組和靜脈灌注組毛發(fā)再生緩慢或再生不全，肢體反復(fù)出現(xiàn)紅斑、腫脹等慢性排斥反應(yīng)直至最后瘢痕形成。動(dòng)脈灌注組大鼠無(wú)明顯不良反應(yīng)，僅有2例大鼠出現(xiàn)術(shù)后移植物傷口愈合稍遲。考慮與皮膚組織環(huán)孢素濃度高，抑制組織活力有關(guān)。
　　 2.生存期觀察
　　 所有經(jīng)環(huán)孢素干預(yù)大鼠的移植物存活期均較

19、單純異體移植組延長(zhǎng)，顯示環(huán)孢素應(yīng)用有利于移植物存活。單純動(dòng)脈灌注小劑量環(huán)孢素(2.5mg·kg-1·day-1)無(wú)法實(shí)現(xiàn)移植物長(zhǎng)期存活，但平均存活天數(shù)為39.4±9.1天，顯著高于等劑量靜脈灌注組（21.0±3.9，P＜0.05）和腹腔注射組（13.6±1.9天，P＜0.01）。給予中等劑量環(huán)孢素(5.0mg·kg-1·day-1)時(shí)，僅動(dòng)脈灌注組大鼠肢體長(zhǎng)期存活（＞100天），顯著優(yōu)于腹腔注射組的46.4±7.0天和靜脈灌注組的56.

20、4±7.0天。大劑量(10mg·kg-1·day-1)時(shí)，三種給藥途徑大鼠移植物均能實(shí)現(xiàn)移植物長(zhǎng)期存活，肢體存活期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.組織學(xué)觀察
　　 單純移植組表現(xiàn)為典型的排斥反應(yīng)，皮膚溶解壞死，移植物大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)。小劑量環(huán)孢素治療下，三種給藥途徑的病理學(xué)表現(xiàn)與單純移植組類似，動(dòng)脈灌注組集中表現(xiàn)為血管周圍炎癥，皮膚與結(jié)締組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。中等～大劑量環(huán)孢素治療時(shí)，腹腔注射組和靜脈灌注組大鼠移植物中仍可見(jiàn)不

21、同程度排斥反應(yīng)。動(dòng)脈組僅有極少單核細(xì)胞浸潤(rùn)或輕微血管周圍炎癥，部分大鼠移植物完全無(wú)排斥反應(yīng)表現(xiàn)。
　　 4.評(píng)價(jià)排斥度比較
　　 長(zhǎng)期存活移植物組織學(xué)評(píng)分顯示，動(dòng)脈灌注組平均排斥度顯著小于等劑量腹腔注射組和靜脈灌注組（P＜0.01）。
　　 5.長(zhǎng)期灌注內(nèi)臟藥物蓄積比較
　　 經(jīng)動(dòng)脈灌注后，肝臟藥物環(huán)孢素濃度較腹腔注射和靜脈用藥分別下降了19％和35％（P＜0.01）。腎臟組織CSA濃度較靜脈組下降31％

22、，與腹腔組相比無(wú)顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 各種給藥途徑應(yīng)用環(huán)孢素均可促進(jìn)移植物存活。尤以動(dòng)脈直接灌注更能延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，降低排斥反應(yīng)程度，長(zhǎng)期應(yīng)用可以減少肝腎藥物蓄積。環(huán)孢素單一藥物全身性給藥，即便采用大劑量仍無(wú)法戒絕復(fù)合組織移植的排斥反應(yīng)。動(dòng)脈灌注中等劑量環(huán)孢素即可實(shí)現(xiàn)免疫耐受，完全抑制排斥現(xiàn)象。單純小劑量環(huán)孢素即便采用局部動(dòng)脈灌注仍不能避免排斥反應(yīng)。維持一定水平的全身血藥濃度有助于控制體液免疫水平，對(duì)于促