重組人肝再生增強(qiáng)因子對(duì)5-6腎切除大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1和Ⅳ型膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的:慢性腎衰竭(Chronic renal failare,CRY)是各種病因引起的腎臟進(jìn)行性的損傷和腎功能的逐漸惡化,嚴(yán)重威脅著病人的生命。慢性腎衰竭腎臟病理表現(xiàn)為腎臟纖維化。腎臟纖維化是指腎臟對(duì)慢性損傷的病理修復(fù)過(guò)程,包括腎間質(zhì)纖維化與腎小球硬化。大量研究已證實(shí),細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過(guò)度沉積是腎小球硬化的主要病理特征。[1]ECM合成和降解的失衡是導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積及腎小球功能損傷的主要

2、原因。[1、2]細(xì)胞外基質(zhì)(ECMI)積聚主要由Ⅳ型膠原構(gòu)成。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果表明Ⅳ型膠原在。腎小球內(nèi)的過(guò)度堆積是腎小球硬化的特征性病理改變。[3、4]因此,Ⅳ型膠原已被廣泛作為腎小球硬化的指標(biāo)。對(duì)于ECM過(guò)度積聚,人們一直關(guān)注ECM合成的增加,近年來(lái)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ECM降解酶系統(tǒng)異常在此過(guò)程中同樣發(fā)揮重要作用。參與腎臟ECM降解的酶類(lèi)主要有:絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)(纖溶酶原激活物-纖溶酶系統(tǒng))和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(matrix meta

3、lloproteinases,MMPs)。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí):MMPs家族是降解ECM的主要酶體系,MMPs具有鋅離子依賴(lài)性,其活化被認(rèn)為是ECM降解的限速環(huán)節(jié)[5]?，F(xiàn)已證實(shí)腎小球系膜細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、臟層及壁層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等均能不同程度地表達(dá)MMP-1、2、3、7、9、10及11。MMP-9作為人體內(nèi)最重要的MMPs之一,它的主要功能是降解ECM的主要成分-Ⅳ型膠原[6]。MMPs

4、的抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases,TIMPs)能夠特異性地封閉MMPs活性。目前已發(fā)現(xiàn)4種TIMPs(TIMP-1、2、3、4),其中對(duì)TIMP-1、2研究較多。TTMP-1可與MMP-9以1:1比例不可逆結(jié)合,特異性的阻斷MMP-9的活性,在ECM積聚和降解的生理平衡中發(fā)揮重要作用。所以MMP-9表達(dá)減弱,TIMP-1表達(dá)增強(qiáng),上述ECM降解效應(yīng)減弱,即能促進(jìn)腎小

5、球硬化發(fā)生。已有許多學(xué)者在多種腎臟病中觀察到TIMP-1表達(dá)增[6-9]。
　　 肝再生增生強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是1994年Hagiya等[10]首次從初斷乳大鼠肝臟中純化并克隆出的一種具有熱穩(wěn)定性的非特異性促進(jìn)肝臟細(xì)胞再生的因子。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)ALR的研究多集中在肝臟,它可以促進(jìn)肝臟再生[11]、抗肝纖維化[12、13]、抑制NK細(xì)胞活性、刺激肝癌細(xì)胞增殖等。但其mR

6、NA在肝臟、腎臟、胸腺、睪丸等組織中均有表達(dá),充分說(shuō)明了ALR具有生物功能多樣性。王愛(ài)民等[14]通過(guò)觀察hALR對(duì)肝星狀細(xì)胞基質(zhì)分解素(MMP-3)及金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)基因表達(dá)的影響,從ECM降解代謝方面探討hALR抗肝纖維化的作用機(jī)制。結(jié)果表明hALR可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞MMP-3的基因表達(dá),從而促進(jìn)ECM的降解,發(fā)揮其抗肝纖維化作用。同時(shí),ALR可抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原和TIMP-1在肝組織中的表達(dá)。據(jù)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道,A

7、LR在腎臟疾病方面的研究包括在急性腎衰竭、腎炎模型、慶大霉素?fù)p傷后的腎小管上皮細(xì)胞中的影響。已證實(shí)ALR直接或間接參與腎炎病理過(guò)程及急性腎小管損傷時(shí)刺激小管上皮細(xì)胞DNA合成等過(guò)程[15]。但目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏ALR與慢性腎衰竭的相關(guān)報(bào)道,鑒于ALR在肝臟纖維化中可以通過(guò)金屬蛋白酶系統(tǒng)阻止肝臟纖維化的發(fā)生與進(jìn)展,而金屬蛋白酶系統(tǒng)在腎臟纖維化中有重要作用。探討rhALR可否通過(guò)影響TIMP-1,MMP-9從而導(dǎo)致Ⅳ型膠原的產(chǎn)生發(fā)生變化,進(jìn)而

8、延緩腎小球硬化,為慢性腎衰竭的防治新方法提供理論依據(jù)。
　　 本課題擬通過(guò)重組人肝再生增強(qiáng)因子(rhALR)對(duì)5/6腎切除大鼠慢性腎衰竭模型進(jìn)行干預(yù)治療,了解rhALR是否可以通過(guò)影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)及Ⅳ型膠原的表達(dá)部位和量,來(lái)延緩腎小球硬化。
　　 方法:
　　 將60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(S組,n=20),對(duì)照組(C組,n=20),干預(yù)

9、組(rhALR組,n=20)。C組及rhALR組大鼠行5/6腎切除,術(shù)后12周慢性腎衰竭大鼠模型制造成功,以rhALR作為干預(yù)藥物對(duì)rhALR組進(jìn)行干預(yù)(200μg/kg/d),用藥1周。血生化檢測(cè)血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)值。石蠟切片行HE和Masson氏染色觀察腎小球病理改變,免疫組化測(cè)定Ⅳ型膠原,MMP-9、TIMP-1的表達(dá),Western-blot測(cè)定MMP-9,TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)

10、表示,組間差異性比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn),顯著性水平等于0.05,應(yīng)用SPSS13.0軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1：血生化檢測(cè)結(jié)果提示:手術(shù)組血清Scr、BUN與假手術(shù)組(S組)相比,明顯升高(P＜0.05)。干預(yù)組(rhALR組)與對(duì)照組(C組)相比,血清Scr、BUN有顯著性差異(P＜0.05.),毒素水平下降。
　　 2：腎臟病理學(xué)結(jié)果顯示:HE染色及Masson氏染色光鏡

11、下可見(jiàn)C組腎小球有不同程度代償性肥大,系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,毛細(xì)血管塌陷,球囊粘連,可見(jiàn)局灶節(jié)段性硬化的腎小球。腎小管腫脹、顆粒變性、偶見(jiàn)灶狀萎縮,腎間質(zhì)增寬,間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)纖維細(xì)胞增生明顯。與rhALR組及S組相比腎小球硬化指數(shù)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值＜0.05。
　　 3：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:在S組,Ⅳ型膠原在腎小球基底膜有少量表達(dá),MMP-9主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,少量表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞,TIMP-1與MMP-

12、9表達(dá)位置接近,只是量較少。在C組,可以明顯的看到Ⅳ型膠原沿腎小球基底膜深棕黃色強(qiáng)表達(dá),較S組表達(dá)增多,MMP-9表達(dá)明顯少于S組,TIMP-1表達(dá)較S組增多。rhALR組各指標(biāo)表達(dá)介于S與C組之間,經(jīng)軟件分析單位面積陽(yáng)性染色區(qū)域平均積分光密度(MOD),rhALR組、C組與S組之間,rhALR組與C組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　 4：Western blot結(jié)果顯示:于S組相比,rhALR組與C組Ⅳ

13、型膠原、TIMP-1蛋白的表達(dá)水平較高,差別有顯著意義(P＜0.05),C組Ⅳ型膠原、TIMP-1的蛋白表達(dá)水平較rhALR組高,同樣有顯著性意義(P＜0.05)。與rhALR組、C組相比,MMP-9在S組表達(dá)量最多,差異有顯著性意義(P＜0.05)。在rhALR組與C組之間,MMP-9表達(dá)在rhALR組相對(duì)較高,差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 rhALR可以通過(guò)上調(diào)MMP-9,下調(diào)TIMP-1,