天南星科有毒中藥凝集素蛋白與毒性的相關(guān)性研究.pdf

1、本學(xué)位論文得到兩項(xiàng)國家自然科學(xué)基金——天南星科有毒中藥礬制解毒共性規(guī)律研究(NO.30973939)、天南星科有毒中藥凝集素蛋白與毒性的相關(guān)性和炮制的影響(NO.81173549)以及江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(NO.CX2211_0786)的資助。
　　 2010版《中國藥典》收載的半夏(Pinelliaternata(Thunb.)Breit.)、天南星(Arisaemaerubescens(Wall.)Schot

2、t)、白附子（TyphoniumgiganteumEngl）及在市場上作為天南星的代用品廣泛使用的掌葉半夏(PinelliapedatisectaSchott.)，均屬于天南星科，為臨床常用有毒中藥，這四種有毒中藥臨床中毒癥狀極為相似，誤服均出現(xiàn)粘膜及皮膚刺激，口舌腫脹，呼吸緩慢甚至窒息死亡，所以中醫(yī)臨床上均使用炮制品。
　　 論文作者所在課題組在前期研究中提出并證實(shí)天南星科四種有毒中藥半夏、掌葉半夏、天南星及白附子的刺激性毒性

3、成分均為其所含有的具有特殊晶形的針晶復(fù)合物，具有強(qiáng)烈的刺激性毒性，可產(chǎn)生嚴(yán)重的刺激性炎癥反應(yīng)，故課題組稱為“毒針晶”。毒針晶主要由草酸鈣、蛋白組成，前期研究發(fā)現(xiàn)組成毒針晶的草酸鈣沒有刺激性作用，而組成毒針晶的蛋白可顯著加重豚鼠破損皮膚的炎癥反應(yīng)。對(duì)半夏毒針晶蛋白研究的結(jié)果顯示，半夏毒針晶上帶有的半夏凝集素蛋白是半夏毒針晶進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)的刺激物，凝集素蛋白可顯著誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，引起大鼠足趾腫脹，可顯著加重毒針晶引起的家兔眼結(jié)膜水腫

4、，具有強(qiáng)烈的促炎作用。天南星科的掌葉半夏、天南星及白附子，與半夏同屬天南星科，刺激性毒性反應(yīng)相似，毒性物質(zhì)基礎(chǔ)都是塊莖中含有的毒針晶，故本論文提出，掌葉半夏、天南星、白附子的毒針晶上也存在與半夏類似的化學(xué)刺激物。對(duì)天南星科有毒中藥凝集素蛋白與毒針晶毒性的相關(guān)性研究，除本課題組外，未見有研究報(bào)道。
　　 本學(xué)位論文以同屬天南星科、毒性表現(xiàn)相似的有毒中藥掌葉半夏、天南星及白附子的毒針晶為研究對(duì)象，以半夏為參照，考察半夏、掌葉半夏、天

5、南星及白附子的毒針晶中是否存在同類的與刺激性毒性相關(guān)的化學(xué)成分，研究表明四種有毒中藥的毒針晶中帶有共性的凝集素(lectin)蛋白成分。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明四種毒針晶中的凝集素蛋白均具有顯著促炎作用，毒針晶的刺激性毒性是凝集素蛋白隨毒針晶刺入組織后誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥刺激性毒性。論文基本闡明了天南星科有毒中藥半夏、掌葉半夏、天南星及白附子凝集素蛋白與毒性的相關(guān)性，主要工作內(nèi)容和研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　 1.天南星科

6、有毒中藥毒針晶蛋白類成分分析及共性刺激性相關(guān)蛋白研究
　　 采用SDS-PAGE(SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis,SDS-PAGE)分析，考察半夏、掌葉半夏、天南星及白附子毒針晶的條帶，是否存在分子量相同的蛋白條帶，結(jié)果顯示分子量約12kDa處有相同的蛋白條帶。繼續(xù)將毒針晶中約12kDa處的蛋白條帶采用混合蛋白膠內(nèi)酶解后肽段的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liqu

7、idchromatographytandemmassspectrogram，LC-MS-MS)技術(shù)分析，結(jié)果顯示四種毒針晶約12kDa的條帶存在共性的凝集素蛋白，分別為半夏凝集素(Pinelliaternatalectin，PTL)，掌葉半夏凝集素(Pinelliapedatisectalectin，PPL)，天南星凝集素(Arisaemaerubescenslectin，AEL)及白附子凝集素(Typhoniumgiganteumle

8、ctin，TGL)。
　　 2.天南星科有毒中藥凝集素的提取分離純化及性質(zhì)研究
　　 從半夏、掌葉半夏、天南星及白附子新鮮塊莖中分離純化相應(yīng)的植物凝集素蛋白PTL、PPL、AEL及TGL。提取分離的流程為：半夏、掌葉半夏、天南星及白附子新鮮塊莖粗提液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、苯基瓊脂糖凝膠(PhenylFF)疏水柱層析、Tris-HCl(pH=8.0)緩沖體系，收集主峰通過強(qiáng)陰離子(QFF)交換柱層析，脫鹽，冷凍干燥分別得PTL

9、、PPL、AEL及TGL。高效體積排阻色譜（size-exclusionhighperformanceliquidchromatography，SEC-HPLC）及SDS-PAGE電泳分析顯示分離所得的PTL、PPL、AEL及TGL均達(dá)到色譜純及電泳純，測得其分子量約為12kDa。通過不同來源紅細(xì)胞、溫度、pH及糖或糖蛋白考察凝集素蛋白的凝集活性，結(jié)果顯示：四種凝集素蛋白均能凝集兔、鼠、狗的紅細(xì)胞，不能凝集雞及人的紅細(xì)胞；80℃以下具有

10、凝集活性,50℃以下凝集活性最強(qiáng)，85℃以上凝集活性全部喪失；pH6.0～10.0范圍內(nèi)具有凝集活性，pH6.0～8.0范圍內(nèi)凝集活性保持穩(wěn)定，pH達(dá)到11.0，凝集活性完全喪失；凝集活性不被D-木糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、無水葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、甲基-α-D-甘露糖苷所抑制，僅被去唾液酸胎球蛋白所抑制。
　　 3.天南星科四種有毒中藥毒針晶中凝集素蛋白與塊莖中凝集素蛋白比對(duì)鑒定
　　 為進(jìn)一步

11、確定毒針晶上帶有的凝集素蛋白是否與相應(yīng)植物塊莖中的凝集素蛋白為同一蛋白，采用SDS-PAGE分析，研究表明從植物塊莖中分離獲得的半夏、掌葉半夏、天南星及白附子的凝集素蛋白與其毒針晶蛋白具有相同的分子量。進(jìn)一步對(duì)塊莖中分離的凝集素蛋白進(jìn)行LC-MS-MS分析鑒定，與美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)從塊莖中提取的凝集素蛋白為對(duì)應(yīng)植物的

12、凝集素蛋白。蛋白免疫印跡Westernblotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)四種毒針晶中含有相應(yīng)的PTL、PPL、AEL及TGL，即從塊莖中提取分離的半夏、掌葉半夏、天南星及白附子凝集素蛋白與相應(yīng)毒針晶上帶有的凝集素蛋白為同一蛋白。
　　 4.天南星科有毒中藥毒針晶中凝集素蛋白的含量研究
　　 前面的研究結(jié)果表明毒針晶上含有凝集素蛋白，采用WesternBlotting方法對(duì)毒針晶上的凝集素蛋白含量進(jìn)行半定量分析，結(jié)果半夏、掌葉

13、半夏、天南星及白附子毒針晶中的凝集素蛋白占毒針晶蛋白上的含量PTL為19.89％，PPL為24.84%，AEL為15.08%，TGL為11.67%，四種有毒中藥凝集素蛋白含量大小順序?yàn)檎迫~半夏＞半夏＞天南星＞白附子，該結(jié)果與前期課題組研究的四種有毒中藥的毒針晶毒性與其蛋白的含量呈相關(guān)性的結(jié)果一致，表明四種毒針晶的毒性與毒針晶中帶有的凝集素蛋白含量呈正相關(guān)。
　　 5.天南星科四種有毒中藥凝集素蛋白的促炎作用研究
　　 采

14、用大鼠腹腔中性粒細(xì)胞遷移模型研究PTL、PPL、AEL及TGL的促炎作用。結(jié)果顯示腹腔注射PTL、PPL、AEL及TGL后，四種有毒中藥的凝集素蛋白出現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞向腹腔遷移的現(xiàn)象并呈劑量依賴性，腹腔液中炎癥介質(zhì)一氧化氮(NitricOxide，NO)、前列腺素E2（ProstaglandinE2，PGE2）及腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)的含量與空白組相比較均顯著升高，表明PTL、

15、PPL、AEL及TGL均可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放。進(jìn)一步考察加熱對(duì)凝集素蛋白致大鼠腹腔中性粒細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示加熱組與空白組比較無顯著性差異，表明加熱可導(dǎo)致凝集素蛋白失活，使其促炎作用顯著下降。
　　 6.天南星科四種有毒中藥凝集素蛋白與毒針晶的刺激性協(xié)同作用研究
　　 采用家兔眼結(jié)膜刺激性模型，家兔破損皮膚刺激性模型和大鼠足趾腫脹模型，考察PTL、PPL、AEL及TGL對(duì)毒針晶所致家兔眼刺激性，家兔破損皮膚刺激性及大鼠

16、足趾腫脹的影響以及加熱處理對(duì)凝集素蛋白及毒針晶誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示單用毒針晶對(duì)家兔眼結(jié)膜具有強(qiáng)烈的刺激作用，單用PTL、PPL、AEL及TGL無刺激性，毒針晶中加入一定量的PTL、PPL、AEL及TGL后對(duì)家兔眼結(jié)膜的刺激性毒性顯著增強(qiáng)，與單用毒針晶組相比呈顯著性差異，表明PTL、PPL、AEL及TGL需要毒針晶刺入黏膜導(dǎo)致黏膜破損才可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，即PTL、PPL、AEL及TGL具有協(xié)同毒針晶引起強(qiáng)烈的家兔眼結(jié)膜刺激性毒性；毒

17、針晶經(jīng)加熱處理后與未處理的毒針晶比較，刺激性明顯降低，表明加熱可破壞毒針晶蛋白的活性，該結(jié)果與凝集素蛋白加熱后促炎活性顯著降低的結(jié)果一致。家兔破損皮膚試驗(yàn)結(jié)果表明凝集素蛋白可加重毒針晶對(duì)家兔破損皮膚的刺激性，加熱處理的凝集素蛋白不增強(qiáng)家兔破損皮膚刺激的作用，呈顯著性差異。同時(shí)毒針晶加熱處理后與未處理的毒針晶比較對(duì)家兔破損皮膚的刺激性顯著降低。大鼠足趾腫脹試驗(yàn)結(jié)果顯示單用凝集素蛋白，通過皮下注射進(jìn)入組織的凝集素蛋白即可引起嚴(yán)重的促炎效應(yīng)，

18、加熱處理后凝集素蛋白組與空白組相比無顯著性差異。毒針晶中加入凝集素蛋白可顯著增強(qiáng)大鼠足趾腫脹，毒針晶組與毒針晶加入加熱處理的凝集素蛋白組比較無顯著性差異，表明加熱可導(dǎo)致凝集素蛋白失活，使其促炎作用顯著下降。同時(shí)加熱處理的毒針晶組與未處理的毒針晶組比較對(duì)大鼠足趾腫脹顯著降低，進(jìn)一步表明毒針晶的刺激性毒性與毒針晶帶有的凝集素蛋白密切相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明凝集素蛋白只有被帶入機(jī)體與組織接觸才可產(chǎn)生促炎效應(yīng)，即凝集素蛋白需要隨毒針晶刺入組織才可

19、產(chǎn)生促炎效應(yīng)，而且加熱可破壞凝集素蛋白的促炎效應(yīng)。
　　 7.天南星凝集素蛋白炎癥刺激性與炎癥相關(guān)細(xì)胞的研究
　　 前述試驗(yàn)證實(shí)天南星科四種有毒中藥的凝集素蛋白可誘導(dǎo)大鼠中性粒細(xì)胞向腹腔遷移，誘發(fā)炎癥發(fā)應(yīng)，這種作用與機(jī)體的炎癥相關(guān)細(xì)胞有何關(guān)系？論文采用動(dòng)物整體試驗(yàn)，腹腔內(nèi)居留細(xì)胞灌洗模型，巰基乙酸鹽(Thioglycolate，Tg)刺激大鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞增殖模型，N-甲基-對(duì)甲氧基苯乙胺和甲醛的縮合物(Compound

20、48/80N-methyl-p-methoxyphenethylaminewithformaldehyde,48/80)致大鼠腹腔內(nèi)肥大細(xì)胞凋亡模型，考察凝集素AEL誘導(dǎo)大鼠中性粒細(xì)胞遷移與居留細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞的關(guān)系。結(jié)果顯示AEL誘導(dǎo)大鼠中性粒細(xì)胞遷移不依賴于居留細(xì)胞，但居留細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞能協(xié)同AEL誘導(dǎo)大鼠中性粒細(xì)胞遷移，肥大細(xì)胞能拮抗AEL誘導(dǎo)大鼠中性粒細(xì)胞遷移。
　　 進(jìn)一步采用體外細(xì)胞試驗(yàn)考察四種凝集素蛋白對(duì)

21、巨噬細(xì)胞的影響，測定炎癥介質(zhì)TNF-α、白細(xì)胞介素IL-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的含量。體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果均表明凝集素蛋白的炎癥刺激性毒性與游離巨噬細(xì)胞并刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)有關(guān)。
　　 論文研究表明，半夏、掌葉半夏、天南星及白附子毒針晶中均帶有相應(yīng)植物的凝集素蛋白，且是毒針晶蛋白中的主要毒蛋白，是天南星科四種有毒中藥毒針晶引起炎癥反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激性毒性的共性化學(xué)刺激物。毒針晶產(chǎn)生刺激性毒性的機(jī)制在于毒針

22、晶刺入組織后，產(chǎn)生機(jī)械刺激性，同時(shí)毒針晶上的凝集素蛋白隨毒針晶進(jìn)入組織誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向刺入部位遷移，促使巨噬細(xì)胞活化，并刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-1β，導(dǎo)致嚴(yán)重的組織水腫和炎癥反應(yīng)。
　　 本論文的研究結(jié)果揭示了天南星科四種有毒中藥半夏、掌葉半夏、天南星及白附子毒針晶產(chǎn)生強(qiáng)烈炎癥刺激性的共性機(jī)制，基本闡明了天南星科有毒中藥凝集素蛋白與其毒性的相關(guān)性，為天南星科有毒中藥炮制機(jī)理的進(jìn)一步深入研究提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，并將為天