替米沙坦激活過氧化物酶體增殖物活化受體δ改善小鼠胰島素抵抗及其機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率逐年增高。2型糖尿病主要由胰島素分泌不足或胰島素功能障礙所引起。胰島素抵抗是由于機(jī)體內(nèi)一定量胰島素的生物活性下降所致,包括胰島素敏感性的下降和反應(yīng)性降低。胰島素抵抗與葡萄糖代謝異常密切相關(guān),因此改善胰島素抵抗及葡萄糖代謝紊亂,是防治2型糖尿病及相關(guān)代謝性疾病的重要途徑。
　　血管緊張素Ⅱ型受體阻斷劑(ARBs)作為一類治療高血壓藥物,常用于

2、治療高血壓患者合并糖尿病或糖尿病腎病。臨床研究發(fā)現(xiàn),ARB類藥物可改善胰島素抵抗、降低高血壓患者糖尿病的發(fā)生率。近年來,一些ARB類藥物,如替米沙坦、厄貝沙坦、洛沙坦等,對胰島素敏感性的作用也引起關(guān)注。臨床研究表明,替米沙坦不僅能改善高血壓合并2型糖尿病患者的胰島素抵抗,穩(wěn)定其血糖,還能增加非糖尿病患者的胰島素敏感性。動物實(shí)驗(yàn)同樣也證實(shí),替米沙坦通過減輕炎癥反應(yīng),改善肥胖大鼠的胰島素抵抗。
　　目前已證實(shí),ARB類藥物,如替米沙坦

3、、纈沙坦等,可以有效的激活過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome prolifer atoractivated receptors,PPARs)。大劑量的替米沙坦可以通過激活PPARγ改善糖尿病合并高血壓患者的胰島素抵抗。而在脂肪組織中敲除PPARγ后,替米沙坦增加脂聯(lián)素水平減少和胰島素刺激下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至脂肪組織中脂滴的敏感性明顯下降。與此相反,肌肉特異性PPARγ缺失后,替米沙坦對脂聯(lián)素水平或葡萄糖代謝,無論是在脂肪或肌肉上

4、幾乎沒有影響。因此,替米沙坦增加脂肪組織中的葡萄糖利用的能力依賴于PPARγ的存在。替米沙坦減少糖尿病高血壓大鼠模型的血清甘油三酯的增加和促進(jìn)肝臟組織中的脂滴減少,其機(jī)制可能與替米沙坦恢復(fù)肝臟、脂肪、肌肉組織中PPARγ、PPARδ、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活蛋白1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC1α)、脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)

5、子4的mRNA表達(dá)有關(guān)。因此,替米沙坦增加胰島素敏感性的作用在臨床及基礎(chǔ)研究中均已得到證實(shí),但是,目前研究尚不清楚替米沙坦引起機(jī)體整體葡萄糖代謝的改善,是否與骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān),替米沙坦具體通過何種分子或通路起作用,亟需進(jìn)一步深入研究。
　　PPARδ(也稱為PPARβ)在各種組織中廣泛表達(dá),尤其在骨骼肌中具有高表達(dá)水平,表達(dá)量分別是PPARγ、PPARα的50、10倍。最近的研究表明,PPARδ在骨骼肌中的葡萄糖代謝

6、和胰島素的作用中至關(guān)重要。Kramer等激活原代培養(yǎng)人骨骼肌細(xì)胞PPARδ,可以直接增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖攝取,促進(jìn)血脂/血糖代謝及增加相關(guān)基因表達(dá)。Schuler等證實(shí)骨骼肌選擇性PPARδ缺失后小鼠表現(xiàn)出肌纖維類型的轉(zhuǎn)換、肥胖和2型糖尿病,表明PPARδ影響外周胰島素敏感性。PPARδ激動劑使小鼠骨骼肌中線粒體的密度增加,增加骨骼肌中脂肪酸代謝的氧化酶和過氧化物酶體β氧化酶的表達(dá)。給予代謝綜合征的患者PPARδ激動劑GW501516

7、干預(yù)兩周,通過增加患者骨骼肌的脂肪酸氧化,可以降低患者的空腹血漿甘油三酯及改善其胰島素抵抗,相對于PPARα激動劑GW590735,效果更明顯。
　　但是,由于PPARδ特異激動劑GW501516等藥理學(xué)作用尚不清楚,還不能用于臨床疾病的預(yù)防和治療。所以,研究替米沙坦等ARB類藥物對PPARδ的功能是否存在影響是非常必要的。由于骨骼肌胰島素抵抗是2型糖尿病的特征性標(biāo)志,我們假設(shè)替米沙坦激活PPARδ的表達(dá)和/或功能,從而影響骨骼肌

8、的葡萄糖代謝。本研究分別于在體和離體水平對上述推論進(jìn)行探討,以期為高血壓合并糖代謝紊亂的高危人群中高血壓藥物預(yù)防及改善胰島素抵抗提供機(jī)制研究和理論依據(jù)。
　　胰島素抵抗是機(jī)體對胰島素生理作用的反應(yīng)性降低,具體表現(xiàn)為外周組織對胰島素敏感性下降以及對葡萄糖的利用障礙。外周胰島素抵抗主要發(fā)生在脂肪、肝臟和骨骼肌,肝臟是外周葡萄糖利用的主要組織之一。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liverdisease,NAFLD

9、)是一種無過量飲酒史、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征,是導(dǎo)致胰島素抵抗及2型糖尿病的重要危險因素。因此,改善非酒精性脂肪肝在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。
　　目前,尚缺乏有效的藥物治療,所以生活方式干預(yù)仍然是非酒精性脂肪肝的一線治療方法。膳食辣椒作為一種膳食方式在全世界范圍廣泛流行,而辣椒素是辣椒的主要成分,也是瞬時受體電位通道香草酸亞型1(transient receptor potential van

10、illoid1,TRPV1)的高選擇性激動劑。我們的前期研究證實(shí),慢性膳食辣椒素具有預(yù)防嚙齒動物高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、降低血壓、減少脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的堆積,降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血清總膽固醇、甘油三酯。我們課題組也發(fā)現(xiàn),膳食辣椒素激活TRPV1可以改善高脂喂養(yǎng)小鼠的胰島素抵抗。因此,膳食辣椒素干預(yù)激活TRPV1是否預(yù)防小鼠非酒精性脂肪肝的進(jìn)展,與UCP2上調(diào)及促進(jìn)脂質(zhì)β氧化及脂質(zhì)分解有何關(guān)聯(lián),是否改善對改善糖代謝有影響,尚需進(jìn)一步研

11、究。
　　本研究包括四個部分:1.C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成熟,觀察替米沙坦不同濃度和不同干預(yù)時間對C2C12細(xì)胞PPARδ活性及表達(dá)的影響。2.用替米沙坦長期喂養(yǎng)PPARδ肌肉特異性基因敲除型(Muscle-specific creatine kinase–peroxisome proliferator–activated receptorδ–knockout,MCK-PPARδ-/-)小鼠及其同窩野生型小鼠,分別觀察替米沙坦長期喂養(yǎng)

12、后對小鼠的體重、進(jìn)食量、葡萄糖耐量及胰島素耐量等指標(biāo)產(chǎn)生的影響。3.觀察替米沙坦及胰島素急性刺激后C2C12和原代培養(yǎng)WT小鼠的骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的不同變化。從分子水平觀察替米沙坦對骨骼肌細(xì)胞及組織PPARδ、PPARα、PPARγ及其它胰島素信號通路分子表達(dá)水平的影響,進(jìn)一步研究替米沙坦影響骨骼肌葡萄糖代謝的分子機(jī)制。4.觀察C57BL/6J、TRPV1-/-小鼠普通飲食組(ND)、高脂飲食組(HD)和高脂飲食加辣椒素組(HC)的進(jìn)

13、食量、血脂、肝組織甘油三酯、脂質(zhì)沉積等變化,免疫印跡法檢測肝組織UCP2表達(dá)。
　　材料和方法:
　　整個研究分在體和離體實(shí)驗(yàn)。在體實(shí)驗(yàn),前三部分以MCK-PPARδ-/-小鼠及其同窩野生型小鼠作為模型。第四部分以C57BL/6J、TRPV1-/-小鼠為模型。離體研究前三部分以小鼠骨骼肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞和原代培養(yǎng)的野生型小鼠骨骼肌細(xì)胞為研究對象。第四部分以HepG2細(xì)胞為研究對象。
　　1.替米沙坦對骨骼肌細(xì)胞PP

14、ARs的表達(dá)及活性的影響。小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后分別用PPARδ質(zhì)粒pAdTrack-CMV–PPARδ轉(zhuǎn)染細(xì)胞,替米沙坦、PPARδ、PPARγ和PPARα的拮抗劑干預(yù)后,熒光素酶檢測C2C12細(xì)胞PPARδ活性,Westernblot技術(shù)分析C2C12細(xì)胞PPARδ、PPARγ、PPARα蛋白表達(dá)。
　　2.替米沙坦干預(yù)對小鼠胰島素抵抗的影響。4-6周齡野生型(wild-type,WT)小鼠和MCK-PPARδ-/

15、-小鼠各24只,隨機(jī)各分為普食組、高脂飲食組。喂養(yǎng)20周后,高脂組小鼠再隨機(jī)選取12只,進(jìn)行替米沙坦干預(yù)10周,即高脂替米沙坦組。觀測喂養(yǎng)第二周的進(jìn)食量,每2周記錄一次每只小鼠體重,分別于第20、30周時,進(jìn)行腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。干預(yù)至第30周,空腹過夜,取頸動脈血檢測甘油三酯、總膽固醇和胰島素,迅速取雙側(cè)腓腸肌,備提總蛋白和胞膜蛋白,-70℃凍存。
　　3.替米沙坦對骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取功能的作用。采用原代

16、骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)WT小鼠骨骼肌細(xì)胞。C2C12細(xì)胞和原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞成熟后換用無血清培養(yǎng)基,加用棕櫚酸、替米沙坦刺激24小時,再用胰島素刺激后,氚-2-脫氧葡萄糖(3H-2-deoxyglucose,3H-2DG)檢測細(xì)胞對2-脫氧葡萄糖(2-Deoxyglucose,2-DG)的攝取率。
　　4.替米沙坦改善骨骼肌細(xì)胞糖代謝的分子機(jī)制。C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后,替米沙坦、PPARδ、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphati

17、dylinositol 3kinase,PI3K)、PPARγ和PPARα的拮抗劑干預(yù)細(xì)胞,胰島素刺激后提取細(xì)胞總蛋白和胞膜蛋白,Westernblot技術(shù)分析C2C12細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase,Akt)、Akt底物蛋白160(Akt substrate of 160 kDa,AS160)和磷酸化Akt、AS160,胞膜Glut4的表達(dá)水平。
　　5.替米沙坦干預(yù)改

18、善小鼠胰島素抵抗的機(jī)制研究。WT和MCK-PPARδ-/-小鼠普食、高脂、高脂替米飲食喂養(yǎng)后,Westernblot技術(shù)分析腓腸肌PPARδ、PPARγ和PPARα的表達(dá),急性胰島素刺激后Akt、AS160和磷酸化Akt、AS160,胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter4,Glut4)的表達(dá)水平變化。
　　6.膳食辣椒素激活TRPV1改善小鼠非酒精性脂肪肝。C57BL/6J、TRPV1-/-小鼠普食、高脂、

19、高脂辣椒素飲食喂養(yǎng)24周,監(jiān)測其進(jìn)食量,干預(yù)結(jié)束后檢測血脂、肝組織甘油三酯,油紅染色觀察肝組織脂質(zhì)沉積等變化,免疫印跡法檢測肝組織UCP2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.PPARδ表達(dá)于小鼠骨骼肌細(xì)胞。替米沙坦能激活PPARδ并上調(diào)PPARδ的活性和表達(dá)水平。替米沙坦激活C2C12肌管細(xì)胞PPARδ呈時間依賴性及劑量依賴性,并能增加PPARγ及PPARα的表達(dá)。
　　2.替米沙坦調(diào)控骨骼肌細(xì)胞PPARs的表達(dá)及活性。P

20、PARδ、PPARγ和PPARα的拮抗劑都能顯著抑制的替米沙坦誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞PPARδ活性增加。PPARδ和PPARα拮抗劑(GSK0660和GW6471)可以產(chǎn)生疊加效應(yīng)增強(qiáng)對C2C12肌管細(xì)胞PPARδ活性的抑制;而PPARδ和PPARγ拮抗劑(GSK0660和GW9662)合用則沒有表現(xiàn)出疊加效應(yīng)。
　　3.替米沙坦干預(yù)改善WT小鼠的胰島素抵抗。以MCK-PPARδ-/-小鼠及其同窩野生型小鼠為觀察對象。高脂飲食喂

21、養(yǎng)20周,WT和MCK-PPARδ-/-小鼠即出現(xiàn)體重顯著高于普食組,葡萄糖耐量、胰島素耐量受損。替米沙坦干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的WT小鼠體重增加,降低血漿胰島素、甘油三酯和總膽固醇水平,改善葡萄糖耐量,增加胰島素敏感性。
　　4.替米沙坦通過上調(diào)PPARδ/PI3K/Akt/Glut4,增加骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取。棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗的C2C12細(xì)胞,胰島素誘導(dǎo)的Akt、AS160的磷酸化和細(xì)胞膜Glut4的表達(dá)非常弱,給予