DNA電化學生物傳感器檢測肺癌患者表皮生長因子受體基因突變狀態(tài)的實驗研究.pdf

1、表皮生長因子受體（EGFR）是細胞通路中傳遞細胞信號的一種重要物質(zhì)。EGFR基因突變狀態(tài)是靶向藥物小分子酪氨酸激酶抑制劑用于非小細胞肺癌的治療療效的重要預(yù)測指標，國內(nèi)外各權(quán)威指南均推薦需對EGFR突變狀態(tài)進行檢測，但目前無標準檢測方法。DNA電化學傳感器具有靈敏度高，特異性好，而且簡便、經(jīng)濟、易行等特點而備受關(guān)注。本課題組在應(yīng)用電化學傳感器檢測基因方面具有一定的研究基礎(chǔ)，前期實驗成功構(gòu)建“基于蛋白質(zhì)控制組裝界面的安培型DNA電化學傳感器

2、”，具有良好的重現(xiàn)性和靈敏度。本研究應(yīng)用前期構(gòu)建的安培型電化學傳感器，采用三明治結(jié)構(gòu)的i-t法，檢測肺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)，并對其外顯子19的6種熱點缺失類型（del1-del6）進行區(qū)分。通過利用DNA雜交特點設(shè)計不同堿基序列，提高特異性，采用引入核酸酶形成雜交酶切循環(huán)和免疫學中的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）等方法提高靈敏度，建立非小細胞肺癌患者EGFR檢測新技術(shù)，實現(xiàn)對臨床肺癌組織實際樣品PCR產(chǎn)物的檢測，本研究最終為

3、DNA電化學傳感器檢測疾病診治相關(guān)基因并廣泛應(yīng)用于臨床奠定實驗基礎(chǔ)。本研究分為四個部分：
　　第一部分：為了提高DNA電化學傳感器的檢測特異性，我們利用DNA在不同相系中雜交效率不同的特點，設(shè)計3種不同序列的DNA:C、R、C/R。3種DNA之間的主要區(qū)別是缺失序列在目標鏈中分布的位置不同，從而使得非互補序列之間的雜交分別發(fā)生在電極表面、雜交液中以及電極表面和雜交液中各一半。實驗結(jié)果表明應(yīng)用 C型 DNA（非互補雜交發(fā)生在電極表面

4、的DNA序列），具有最佳的雜交特異性，并用其構(gòu)建具有高特異性的DNA電化學傳感器。同時，我們對人工合成雙鏈樣品的測定進行研究，比較了高溫變性和λ-exo消化兩種制備單鏈 DNA的方法對電化學檢測的影響。結(jié)果表明，λ-exo消化產(chǎn)物可得到接近人工合成單鏈的電流值，且無復(fù)性等弊端，與三明治檢測系統(tǒng)不存在相互作用，可作為獲得單鏈的方法與DNA電化學傳感器三明治檢測系統(tǒng)聯(lián)用。隨后，應(yīng)用所構(gòu)建的DNA電化學傳感器對臨床肺癌組織的PCR產(chǎn)物進行檢測

5、。實驗設(shè)計6種不同的引物并優(yōu)選PCR結(jié)果最好的引物進行后續(xù)實驗。通過λ-Exo對PCR產(chǎn)物的處理，成功獲得目標ssDNA，應(yīng)用DNA電化學傳感器采用i-t法檢測，根據(jù)所得電流信號可區(qū)分野生型與缺失型EGFR。
　　第二部分；對EGFR外顯子19的6種常見缺失類型進行區(qū)分。第一部分實驗結(jié)果證實，非互補序列之間的雜交發(fā)生在接近電極表面的傳感器特異性更高，本部分為達到各種缺失類型間的最大區(qū)分度，通過設(shè)計不同探針，對DNA探針中非互補序列

6、的位置進行優(yōu)化，研究在電極表面的非均相雜交環(huán)境中，非互補雜交發(fā)生在捕獲探針上的不同位置對雜交特異性的影響，結(jié)果顯示非互補序列分布在捕獲探針中段時，單堿基錯配的del1和del2之間可顯示最佳區(qū)分度，此時雜交特異性最好。基于此結(jié)果，結(jié)合EGFR常見的6種突變類型進行捕獲探針設(shè)計，并根據(jù)檢測電流結(jié)果進行適當分組，簡化工作量，實現(xiàn)了快速區(qū)分EGFR基因外顯子19的突變類型。同時運用以上的方法對實際樣品的PCR產(chǎn)物進行檢測，所得結(jié)果與測序結(jié)果相

7、符，證明了本檢測方法的準確性，成功用于實際樣品區(qū)分EGFR外顯子19的6種熱點缺失類型。
　　第三部分：將前兩部分應(yīng)用的“基于蛋白質(zhì)控制組裝界面的安培型DNA電化學傳感器”與核酸外切酶輔助形成的雜交-酶切循環(huán)信號放大系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)建一種在液相的均相介質(zhì)中進行酶切的具有放大效應(yīng)的復(fù)合體系。通過目標鏈與輔助鏈雜交形成雙鏈，觸發(fā)核苷酸酶對雙鏈中的輔助鏈的識別及剪切作用，形成雜交-酶切循環(huán)，使少量目標鏈通過多次重復(fù)利用而達到放大檢測信號的

8、目的。為了選擇最適外切酶，對Exo-III和λ-Exo進行比較，根據(jù)結(jié)果選擇λ-Exo參與反應(yīng)，同時對雜交酶切的反應(yīng)時間，酶切濃度等條件進行優(yōu)化。并進一步考察了生物素在雙鏈中的位置對檢測信號的影響，發(fā)現(xiàn)縮短生物素與電極表面距離，可增加檢測響應(yīng)電流信號，并依此優(yōu)選生物素在三明治構(gòu)型傳感器中的位置。本部分所構(gòu)建的傳感器較之單獨BSA控制組裝的體系，可顯著降低檢測限至0.01nM，線性范圍是2.0×10-11-4.0×10-10M，并具有良好

9、的特異性，可區(qū)分野生型與缺失型EGFR。
　　第四部分：將酶切對象改變?yōu)樾盘柼结?，使信號探針具有可被酶切及信號報告的雙重作用，簡化雜交酶切循環(huán)體系，減少參與反應(yīng)的DNA的種類數(shù)，使檢測對象能夠更直接地反映目標序列的存在情況。同時，為了擴大信號探針的響應(yīng)信號，提高靈敏度，我們引入了免疫學中 SABC法，通過鏈霉親和素標記的辣根過氧化酶（SA-H）與生物素標記的辣根過氧化酶（B-H）形成復(fù)合物，并將復(fù)合物與電極表面的生物素結(jié)合，可增加