調(diào)肝治法方藥抗心理應激損傷的部分神經(jīng)免疫學機制研究.pdf

1、一、文獻綜述與理論探討: 本研究團隊以往一系列研究亦表明：中醫(yī)肝主疏泄調(diào)暢情志的功能在實現(xiàn)對下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的整體性調(diào)節(jié)上，還可能存在著一定的具體的中樞神經(jīng)機制；在作用機理上體現(xiàn)出局部(中樞神經(jīng)機制)與整體(NIM 網(wǎng)絡)的有機統(tǒng)一。并且以加味四逆散(JWSNS)為調(diào)肝治法方藥之代表方，采用“方-證-效-臟腑功能本質(zhì)”的研究思路，對慢性應激損傷及調(diào)肝方藥的作用機制進行了一系列的研究，探討肝主疏泄調(diào)暢情志功能的中樞神經(jīng)

2、生物學機制，其具體機制有待一步探討。 本論文旨在進一步研究不同性別、年齡情況下慢性心理應激反應損傷的HPA軸等神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學作用機制，以及中藥復方對其的干預作用，為最終從整體上闡明心理應激作用機制及中醫(yī)調(diào)肝治法方藥抗心理應激損傷的作用機理奠定基礎。 二、研究目標與內(nèi)容: 研究目標：開展調(diào)肝方藥——加味四逆散(JWSNS)抗心理應激損傷HPA軸作用方式及其神經(jīng)內(nèi)分泌免疫變化的實驗研究，嘗試闡明調(diào)肝治法抗不良心理應

3、激損傷的神經(jīng)內(nèi)分泌作用機制，探求安全有效的中醫(yī)藥抗心理應激方法。進而，從細胞及分子水平進一步探討調(diào)肝方藥一加味四逆散(JWSNS)在心理應激損傷狀態(tài)下多層次、多靶點調(diào)控 NIM 網(wǎng)絡的作用機制，更加深入揭示加味四逆散抗心理應激損傷的神經(jīng)免疫學的物質(zhì)基礎及其作用方式。 研究內(nèi)容：建立慢性輕度不可預計應激損傷大鼠模型，檢測各試驗組分中免疫功能的變化，及其神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控過程中外周與中樞各類激素等主要生化指標與病理改變，觀察調(diào)肝方藥JW

4、SNS的調(diào)控作用，以HPA軸為重點，探討其作用可能的機制與途徑，研討調(diào)暢情志疏肝之法在抗心理應激損傷中的作用機理。 (一)慢性輕度不可預計應激損傷大鼠模型的建立 本實驗目的在于建立慢性輕度不可預計應激模型，觀察不同年齡、性別大鼠模型的特征。用表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預測效度三個效度對其進行綜合評價。大鼠基本狀況觀察結(jié)果表明，隨著造模工作的進行，模型組大鼠整體狀況不斷明顯下降，焦慮，煩躁不安，排便增多，部分過程拒絕，呼吸急促，

5、毛色發(fā)黯，發(fā)黃，存在修飾行為，但不斷減少，直到基本消失。治療組整體狀態(tài)強于模型組，但略弱于正常組，表現(xiàn)為較安靜，毛色雖雜亂，但略有光澤，修飾行為減少，抵抗行為減少，表明經(jīng)中藥復方JWSNS組干預，基本狀況有好轉(zhuǎn)，但在應激源未解除之前，仍較疲倦。糖水消耗偏愛度是判斷大鼠抑郁應激程度的重要指標。數(shù)據(jù)表明，模型大鼠糖水消耗偏愛度減少，提示模型成功，而中藥復方JWSNS干預，糖水消耗偏愛度顯著提高，與正常組無顯著差異，提示中藥復方JWSNS可能

6、干預慢性心理應激損傷，此結(jié)果與以往一致。其中，幼年鼠正常組因處于生長期，糖水消耗偏愛度隨體重呈增長趨勢，但模型組三周后糖水消耗偏愛度顯著減少 (p<0.01)，表明慢性應激對其產(chǎn)生較為嚴重的損傷，導致其不升反降；成年鼠正常組糖水消耗偏愛度未顯示隨體重而增長趨勢，模型組三周后糖水消耗顯著減少(p<0.01)，經(jīng)中藥治療有顯著改善(p<0.01)，表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。體重方面，各組正常大鼠體重增長平穩(wěn)，雄性組略快，而經(jīng)造模后體重增長顯著變緩

7、(p<0.01)，提示長時間應激導致機體的綜合狀況顯著下降，經(jīng)治療后有改善，但與正常組相比仍有顯著差異(19<0.01)，無法復原，表明中藥復方可以有效緩解其應激狀態(tài)，但無法改變其只要應激源持續(xù)存在就必然所造成的損傷與壓力。 性別是影響應激作用的重要因素。結(jié)果表明，就心理應激而言，雌性和雄性動物之間存在顯著的性別差異，兩種動物在行為表現(xiàn)、內(nèi)分泌和病理生理等多個方面也存在顯著差別。雌雄間比較，雄性對糖水消耗偏愛度更為穩(wěn)定一些，總體

8、趨勢呈下降；雌性大鼠則在第一周即出現(xiàn)顯著下降，隨后又有所恢復，進而第三周又顯著下降，提示雌性可能對急性應激更為強烈，進而轉(zhuǎn)為慢性應激狀態(tài)。 (二)加味四逆散對慢性心理應激大鼠下丘腦-垂體-靶腺軸的調(diào)節(jié) 本實驗旨在觀察慢性心理應激狀態(tài)下大鼠腎上腺、甲狀腺、性腺軸的外周分泌激素的改變及其主要作用途徑。本研究結(jié)果顯示，成年組雄激素有顯著改變，雌性激素有改變趨勢，而T3、T4 含量無明顯改變。表現(xiàn)為，雄性造模組雄激素顯著升高 (

9、p<0.01)，經(jīng)JWSNS治療后下降與正常組無顯著差異，提示心理應激對成年雄性大鼠HPG外周功能造成了影響，經(jīng)中藥干預后顯著下降，很好地起到調(diào)控應激損傷的作用；HPA軸是慢性心理應激反應的主要途徑。本實驗結(jié)果顯示，慢性應激作用下HPA軸發(fā)生了顯著變化，而雌雄間顯示一定的差異。從HPA 軸整體分泌上來看，本實驗充分顯示出 CRH、ACTH、CORT三者間的相互作用確實存在，同時也可解釋本實驗當中，雌雄組間不同的變化趨勢及多組數(shù)據(jù)僅有趨勢

10、而無顯著差異的結(jié)果。例如，本實驗總的趨勢是 HPA 軸的激活與亢進狀態(tài)，但雌性組卻 CORT 僅顯示出趨勢，其機制有待進一步闡明，但結(jié).ACTH 的顯著下降，是否可以看出ACTH對其的調(diào)控作用，即正是由于模型組ACTH的減少，從而使CORT的升高變緩。雄性組方面，ACTH 的變化僅有升高趨勢，其同樣存在CORT顯著升高后，對其的反饋性調(diào)節(jié)，從而導致其增高的顯著性變化減弱。而下丘腦CRH顯著高于對照組，可能是對下丘腦對血漿 ACTH、CO

11、RT 改變的反饋性調(diào)控的結(jié)果。 本次實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組腎上腺皮質(zhì)其形態(tài)學發(fā)生改變，提示慢性心理應激大鼠腎上腺內(nèi)分泌功能處于亢奮狀態(tài)，表現(xiàn)為皮質(zhì)增生明顯，細胞密度增高等，而中藥治療組明顯好轉(zhuǎn)，表明中藥復方對腎上腺內(nèi)分泌激素的分泌有很好的調(diào)控作用，可抑制其皮質(zhì)增生，進而減緩糖皮質(zhì)激素的分泌。結(jié)合其免疫功能顯著抑制與降低，表明二者間的一定的因果關(guān)系。 (三)加味四逆散對慢性心理應激大鼠免疫功能的調(diào)節(jié) 本

12、實驗旨在觀察慢性應激狀態(tài)下大鼠免疫功能的變化，探討其與神經(jīng)內(nèi)分泌改變的關(guān)系，嘗試明確其HPA軸主要作用途徑。結(jié)果表明，模型各組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低，經(jīng)中藥復方干預后，胸腺指數(shù)顯著回升，表明中醫(yī)復方JWSNS可以有效提高應激反應后的免疫功能改變。模型各組胸腺形態(tài)學發(fā)生嚴重改變，反映出慢性應激反應后大鼠免疫抑制顯著，經(jīng)中醫(yī)復方JWSNS治療后器官形態(tài)有顯著改善，提示可以有效提高應激反應后的免疫功能改變。T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的

13、免疫細胞，對人體免疫功能有重要的調(diào)節(jié)作用，本次實驗結(jié)果表明，雌性大鼠模型組CD3+、CD4+、CD8+均呈下降，CD3+下降有顯著差異(p<0.05)，經(jīng)中藥復方治療后T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+顯著回升，CD8+呈上升趨勢，并高于正常組，也顯示出雌性對應激干預手段與藥物的敏感性；而雄性組方面，模型組T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)均有所下降，經(jīng)中藥復方JWSNS治療后，有所回升，但均未達到統(tǒng)計學意義。模型各組CD4+

14、與CD8+比值呈下降趨勢，中藥復方各組有所提高，但未有統(tǒng)計學意義，可能與實驗大鼠例數(shù)相對較少有關(guān)，尚需進一步觀察與探討。雌雄間比較顯示，雄性應激免疫抑制趨勢更加明顯一些，與以往報道一致。 (四)加味四逆散對慢性心理應激大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用觀察 慢性應激狀態(tài)下大鼠中樞海馬神經(jīng)元的變化，探討其對外周神經(jīng)內(nèi)分泌改變的調(diào)控，嘗試明確其對HPA軸主要作用途徑。海馬不僅是應激反應的高級調(diào)節(jié)中樞也是應激損傷的敏感區(qū)。本次研究結(jié)果表

15、明，與正常組相比，雌雄模型組細胞凋亡率均明顯增加，海馬光密度值顯著低于正常組，海馬組織損傷明顯高于正常組；與模型組相比，雌雄JWSNS組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯下降，JWSNS能明顯升高應激大鼠海馬光密度值，減輕組織損傷，提示不可預計應激模型大鼠已引起海馬神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)海馬損傷及神經(jīng)元細胞的凋亡。而經(jīng)加味四逆散治療干預后，海馬組織損傷明顯降低，表明其可能很好的緩解海馬損傷與神經(jīng)元細胞的調(diào)亡，具有較好的海馬神經(jīng)元保護作用。

16、 三、研究結(jié)論: 1．本實驗對慢性不可預計心理應激大鼠模型和復制與改制較為成功，從表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預測效度三個效度對其進行綜合評價，表明該模型大鼠行為學表現(xiàn)與人類相應的情緒表現(xiàn)具有一定的相似性；其反映出一定的情緒障礙的行為學和生理學的基本特征，以及共同的神經(jīng)生物學機制——HPA軸的調(diào)控等。而中藥復方JWSNS可有效調(diào)控慢性心理應激狀態(tài)下機體的NIM網(wǎng)絡改變。 2．慢性心理應激反應的神經(jīng)內(nèi)分泌通路主要是HPA系統(tǒng)，此系

17、統(tǒng)的激活是應激性外周軀體反應、免疫功能紊亂等的生理學基礎，而中藥復方JWSNS可有效調(diào)控HPA軸，提示其抗應激損傷作用機制與HPA軸密切相關(guān)。 3．慢性心理應激反應在不同性別中存在一定差異。心理應激可影響到下丘腦—垂體—性腺(HPG)軸的功能，JWSNS顯示出對HPG一定的調(diào)控作用，但由于不同性別性腺激素分泌的復雜性，JWSNS作用機制與方式有待進一研究。 4．研究結(jié)果表明，慢性應激反應大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高，提示