辣椒疫霉中兩個(gè)RxLR效應(yīng)因子的功能與作用機(jī)制研究.pdf

1、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）是一類(lèi)重要的病原卵菌，其寄主廣泛，能夠侵染茄科（辣椒，番茄）、豆科（利馬豆，豆角）和大部分瓜類(lèi)等植物并能造成毀滅性的災(zāi)害?，F(xiàn)階段，針對(duì)該病害的防治還缺乏有效的措施，由于辣椒疫霉菌容易變異且病害流行蔓延速度快，生產(chǎn)上使用的一些殺菌劑往往達(dá)不到很好的效果。那么，從辣椒疫霉的致病機(jī)理入手，尋找有效的作用靶標(biāo)對(duì)該防治病害至關(guān)重要。
　　辣椒疫霉為半活體營(yíng)養(yǎng)菌，在活體營(yíng)養(yǎng)階段會(huì)分泌一系列效

2、應(yīng)因子來(lái)調(diào)控植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)從而促進(jìn)其侵染定殖。在種類(lèi)多樣的外泌蛋白物中，一類(lèi)與致病性相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)因子被發(fā)現(xiàn)。該類(lèi)效應(yīng)因子的N端具有RxLR-dEER基序和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域，起著分泌和靶定寄主細(xì)胞內(nèi)蛋白的功能，而其C端是功能活性區(qū)，有調(diào)控寄主防衛(wèi)反應(yīng)的作用。明確此類(lèi)效應(yīng)因子的功能和作用機(jī)制有利于揭示疫霉菌致病的分子機(jī)制，并為進(jìn)一步利用抗病基因工程方法開(kāi)發(fā)疫霉病害的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。
　　我們通過(guò)辣椒疫霉侵染階段的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、

3、生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)等對(duì)效應(yīng)因子的功能進(jìn)行分析，篩選得到了一個(gè)能夠引起煙草細(xì)胞死亡的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)因子PcRxLR207和一個(gè)能夠促進(jìn)辣椒疫霉侵染的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)因子PcRxLR103，并對(duì)這兩個(gè)效應(yīng)因子展開(kāi)作用機(jī)制的研究，結(jié)果如下:
　　PcRxLR207具有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡活性，其靶標(biāo)蛋白為RBPs:通過(guò)對(duì)多個(gè)辣椒疫霉效應(yīng)因子進(jìn)行功能鑒定，我們發(fā)現(xiàn)PcRxLR207能夠在煙草上引起細(xì)胞死亡。為明確其在植物體內(nèi)的作

4、用位點(diǎn)，我們通過(guò)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PcRxLR207僅分布在細(xì)胞質(zhì)中。為了深入了解PcRxLR207的作用機(jī)理，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)去釣取擬南芥基因cDNA文庫(kù)，得到了可能與PcRxLR207互作的靶標(biāo)基因BPA11、RRMP1、RRMP2和RRMP3。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，靶標(biāo)基因均具有保守的RNA-binding motif,均可能表達(dá)RNA-binding proteins(RBPs)。在此基礎(chǔ)上我們通過(guò)兩種

5、公認(rèn)的互作驗(yàn)證系統(tǒng)酵母雙雜交(Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)驗(yàn)證得到PcRxLR207能夠與RBPs直接互作，并且互作位點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì)中。另外，對(duì)RBPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，RBPs在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)兩蛋白單獨(dú)定位和相互作用后的位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，推測(cè)PcRxLR207可能通過(guò)改變RBPs的定位來(lái)降低其活性從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)異常，促進(jìn)辣椒疫霉的侵染。
　　PcRxLR103能夠促進(jìn)辣椒疫霉的侵染，并在侵染初

6、期和后期發(fā)揮著重要作用:本章從辣椒疫霉菌中成功克隆了多個(gè)RxLR效應(yīng)因子，并將其構(gòu)建到病毒表達(dá)載體PVX。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，在本氏煙葉片中分別瞬時(shí)表達(dá)這幾個(gè)效應(yīng)因子后再接種辣椒疫霉菌，獲得了一個(gè)能夠顯著促進(jìn)疫霉菌侵染的效應(yīng)因子PcRxLR103。實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明PcRxLR103在侵染階段上調(diào)表達(dá)，表明其在侵染過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。細(xì)胞死亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PcRxLR103可以誘導(dǎo)微弱的植物細(xì)胞死亡，然而該細(xì)

7、胞死亡誘導(dǎo)活性與促進(jìn)病原菌侵染的毒性功能之間的關(guān)系尚不明確，推測(cè)其可能通過(guò)抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)來(lái)促進(jìn)病原菌的侵染。為明確其作用機(jī)理，一方面我們通過(guò)花序浸染方法和FAST技術(shù)，將PcRxLR103轉(zhuǎn)化進(jìn)入擬南芥植物中并通過(guò)熒光顯微鏡篩選得到可以激發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因種子T0代。同樣，通過(guò)種植，收獲，篩選等步驟，可培育至T3代，獲得穩(wěn)定遺傳植株。利用轉(zhuǎn)有PcRxLR103基因的擬南芥植株，可以開(kāi)展基因功能、信號(hào)通路等的研究。另一方面我們通過(guò)酵母