一株同時產(chǎn)CTX-M-15、ARMA酶的產(chǎn)酸克雷伯菌研究.pdf

1、一直以來認為氨基糖苷類藥物最重要的耐藥機制為細菌產(chǎn)生鈍化酶，使抗生素失活。2003年日本學者首次報道了16S rRNA甲基化酶，細菌一旦獲得該基因將表現(xiàn)為對所有氨基糖苷類抗生素的高水平耐藥[1]。16S rRNA甲基化酶作用于氨基糖苷類抗生素共同的作用靶位16S rRNA，通過翻譯后的甲基化修飾，使得兩者親和力下降，導致高水平的氨基糖苷類抗生素耐藥，從而導致藥物治療失敗。因為甲基化酶修飾的是所有氨基糖苷類抗生素共同的作用位點，一旦這種修

2、飾發(fā)生就意味著目前使用的氨基糖苷類藥物都將失去作用，并且耐藥菌的MIC往往高達512-1024μg／ml[1-5]。16S rRNA甲基化酶基因常和碳青霉烯酶或者ESBLs編碼基因連鎖傳播，并通常由質粒介導，常與可移動基因元件(插入序列、轉座子)相關，質粒的交換和轉座子的轉座作用都有利于耐藥基因在細菌間的播散[6]。16S rRNA甲基化酶基因在世界各地如亞洲、歐洲等地相繼出現(xiàn)有關報道，越來越引起廣泛關注。 我們對實驗室保存的1

3、998-2002年之間北京、浙江、新疆、河南、江蘇、湖北6個地區(qū)臨床分離的產(chǎn)ESBLs的447株腸桿菌科細菌進行了研究。采用Etest法測定抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)，通過聚合酶鏈反應(PCR)、接合試驗、質粒抽提、Southern雜交、測序等方法對耐藥基因及其傳播機制進行研究。447株產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科細菌中，27株產(chǎn)SHV型ESBLs(占6.O％)，341株產(chǎn)CTX-M-9型ESBLs(76.3％)，112株產(chǎn)CTX-M-1

4、型ESBLs(25.6％)。 在所有臨床分離菌株的PCR產(chǎn)物中，均未檢測出rmtA、rmtB、rmtC和rmtD型基因，但發(fā)現(xiàn)其中一株產(chǎn)ARMA型16S rRNA甲基化酶，序列分析顯示其PCR產(chǎn)物與almA序列完全一致(基因序列號AY220558)。經(jīng)鑒定，該菌株為產(chǎn)酸克雷伯菌，于2001年臨床分離自一位江蘇患者的血培養(yǎng)標本。藥敏試驗顯示該產(chǎn)酸克雷伯菌對5種氨基糖苷類藥物均高度耐藥(MIC>1024μg／ml)，且同時對環(huán)丙沙星

5、及除碳青霉烯類和頭孢他定與克拉維酸復合物外的β內酰胺類或β內酰胺類與酶抑制劑復合物耐藥，而替加環(huán)素及多粘菌素E對該菌株顯示出良好的藥物敏感性。該產(chǎn)酸克雷伯菌株中未檢測出SHV型、CTX-M-2型、CTX-M-8型及CTX-M-9型ESBLs，但發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)CTX-M-1型及TEM型ESBLs,序列分析顯示其為blaCTX-M-15型ESBLs及blaTEM-1型廣譜酶。同時，該菌株中檢測出GyrA基因的第87位氨基酸由Asp突變?yōu)锳la，該

6、位置的突變導致細菌對環(huán)丙沙星的耐藥。接合試驗(原始菌為產(chǎn)酸克雷伯菌，受體菌為大腸埃希菌600)后的PCR產(chǎn)物經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)armA、blaCTX-M-15及blaTEM-1基因可同時接合至受體菌中。從原始菌及受體菌中均抽提到一大小約55kb的質粒，質粒Southern雜交證實該質粒同時攜帶armA、blaCTX-M-15及blaTEM-1基因。對PCR產(chǎn)物的電泳試驗及序列分析顯示，該產(chǎn)酸克雷伯菌株中檢測出的armA基因的上游序列及下游序列與

7、法國學者自肺炎克雷伯菌(基因號AY220558)、日本及西班牙學者自大腸埃希菌(基因號AB117519、AY522431)及波蘭學者自弗氏檸檬酸桿菌(基因號NC00446)中分離的armA基因的基因環(huán)境完全一致。以上研究表明，攜帶有16S rRNA甲基化酶的產(chǎn)酸克雷伯菌可表現(xiàn)出對氨基糖苷類藥物的高度耐藥，并且armA基因與blaCTX-M-15及blaTEM-1型β-內酰胺酶位于同一質粒中，同時介導對大部分p內酰胺類藥物耐藥。16SrR