青蒿鱉甲湯對ANLL-CR患者BMNC來源DC誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、目的: 本實驗以體外培養(yǎng)的方法，將達到完全緩解標準的急性髓細胞白血病患者骨髓中分離出去T細胞的骨髓單個核細胞(TD-BMNC)，以青蒿鱉甲湯含藥血清與細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)，觀察含藥血清對此來源的樹突狀細胞（DC）分化成熟的影響。用此法誘導(dǎo)分化的樹突狀細胞（DC）與純化的正常人和緩解期患者外周血T細胞共同培養(yǎng)，觀察對T細胞增殖能力的影響。用激發(fā)的T細胞與白血病細胞株(K562)共同培育，以MTT法測定該T細胞對K562細胞株的殺傷活性

2、，探討扶正透毒祛毒方藥對急性髓細胞白血病患者DC的免疫功能的影響。 方法: 從正常人外周血及急性髓細胞白血病患者完全緩解后外周血分離純化得到T細胞，應(yīng)用綿羊紅細胞玫瑰花結(jié)程序從ANLL-CR患者骨髓中分離出去T細胞的骨髓單個核細胞（TD-MNC），制備中藥含藥血清，用含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整TD- BMNC細胞濃度后加入6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)9～12d，每3～4d換液1次，以不同濃度中藥含藥血清與細胞因子（

3、GM-CSF、IL-4、TNF-α）聯(lián)合培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中動態(tài)觀察細胞生長，七天后流式細胞儀檢測DC表面免疫分子CD86、CD1a、HLA-DR的表達，分別收集純化的同種異體T細胞、AML-CR患者自體T細胞，與AML-CR患者TD-MNC來源的DC以10：1比例加入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)5d，培養(yǎng)基中加入100U/ml的IL-2進行同種異體T細胞及自體T細胞的激發(fā)，激發(fā)后的各組T細胞與K562細胞分別以10：1、20：1、40：1效：靶比例

4、培養(yǎng)24h，MTT法檢測不同條件培養(yǎng)的DC誘導(dǎo)T細胞的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果： 新鮮分離的的ANLL－CR患者去T細胞的骨髓MNC（TD-BMNC），經(jīng)2h的貼壁，去除懸浮的淋巴細胞分離后，剩下的貼壁細胞加入不同中藥含藥血清和細胞因子組合的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)前3天大部分細胞呈貼壁生長，體積小、圓形、細胞邊界光滑；4－6天懸浮細胞數(shù)量增多，體積增大，可見毛刺樣突起，含藥血清聯(lián)合細胞因子組尤為明顯，誘導(dǎo)培養(yǎng)9

5、天后細胞出現(xiàn)明顯的樹突狀突起，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)豐富，并有成簇現(xiàn)象，細胞具有DC的典型形態(tài)學(xué)特征。ANLL－CR患者去T細胞的骨髓MNC（TD-BMNC）均能分化為形態(tài)特征典型的DC，能表達成熟DC的特異性標記（CD-86和CD-1a），高表達HLA-DR。 結(jié)論： 聯(lián)合運用GM-CSF、IL-4、TNF-α和青蒿鱉甲湯含藥血清，可從來源于AML-CR患者的TD-BMNC誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC，該來源的DC能誘導(dǎo)自體和健康自愿