肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、背景與目的：
　　 在世界范圍內(nèi)癌癥死因排序中，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)居第3位，而90％的結(jié)直腸癌病人死于腫瘤轉(zhuǎn)移。目前認為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是癌細胞通過遺傳及表觀遺傳途徑獲得一系列特殊生物學功能的多因素、多步驟的過程。與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因相繼被發(fā)現(xiàn)，以乳腺癌為例，檢測轉(zhuǎn)移基因的診斷試驗已經(jīng)初步顯示出這些基因在預后評估及治療選擇中的作用。然而，轉(zhuǎn)移基因的診斷試驗在結(jié)直腸癌的預后評估中仍未被廣泛應(yīng)用，TN

2、M分期仍然是目前評估病人預后的主要手段。
　　 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是區(qū)分I/II期與III期結(jié)直腸癌的一個重要標志，也是治療方案選擇的一個重要指標。然而，是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通常需手術(shù)后才能確定，且往往受到手術(shù)摘除的淋巴結(jié)數(shù)目的影響。這意味著使用這種分期方法十分容易低估(understage)病人的腫瘤分期，進而影響下一步治療方案的選擇及病人的預后。因此，建立分子學分期系統(tǒng)(molecular staging)有助于更準確的進行預后評估及

3、治療選擇，并且已逐漸成為腫瘤防治的一個主流方向。本研究通過比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中腫瘤細胞的蛋白表達差異，并通過質(zhì)譜分析獲得蛋白質(zhì)序列，以期發(fā)現(xiàn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白標志物，為預防及控制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供分子基礎(chǔ)。
　　 此外，在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細胞必需首先侵襲突破細胞外基質(zhì)，進入血液或淋巴循環(huán)，并以低密度的腫瘤細胞數(shù)量在腫瘤微環(huán)境外生存，產(chǎn)生抵抗Anoikis凋亡(細胞脫離細胞基質(zhì)而進入程序性死

4、亡)的能力，最終到達靶器官，并定植增生形成轉(zhuǎn)移灶。目前認為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移播散能力的重要途徑。本研究在通過蛋白質(zhì)組學分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性的結(jié)直腸癌標本的基礎(chǔ)上，對新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移標志物，肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin進行了進一步的生物學功能分析，以了解Transgelin在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中所起的作用，以及Transgelin與E

5、MT的關(guān)系，為進一步治療干預提供新的靶點。本研究分兩部分：
　　 第1部分：結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異蛋白質(zhì)組學分析
　　 第2部分：Transgelin調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　 方法：
　　 第1部分：本研究采用激光顯微切割(laser capture microdissection，LCM)從冰凍切片上獲得結(jié)直腸癌腫瘤細胞，進行蛋白提取及熒光定量標記，進而通過雙向差異凝膠電泳(two-dimen

6、sional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)，比較12例淋巴結(jié)陰性及12例淋巴結(jié)陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中腫瘤細胞的蛋白表達差異，并通過質(zhì)譜分析獲得蛋白質(zhì)序列。在結(jié)直腸癌組織芯片上進行Transgelin免疫組織化學染色，明確Transgelin在淋巴結(jié)陰性和陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達水平。
　　 第2部分：利用RNAi技術(shù)，通過microRNA靶向下調(diào)(knockdown) Tra

7、nsgelin表達，建立HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD結(jié)腸癌穩(wěn)定細胞系及相應(yīng)的對照細胞系，分析細胞的體外侵襲能力、細胞集落形成能力、抵抗Anoikis凋亡的能力，以及Transgelin與EMT的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過LCM/2D-DIGE獲得的結(jié)直腸癌細胞和正常粘膜細胞的蛋白點表達豐度的中位技術(shù)變異常數(shù)分別為9.37％和10.09％，根據(jù)這一數(shù)值計算，要檢出不同組之間蛋白表達差異

8、達到2倍以上的蛋白點，并維持Ⅰ類錯誤概率少于0.05及檢驗效能達到80％，每實驗組至少需要10例樣本。
　　 2.每張2D膠上平均獲得2100個蛋白點，其中980個蛋白點的膠與膠之間匹配率達到90％以上，16個蛋白點在淋巴結(jié)陰性和陽性的結(jié)直腸癌細胞中存在差異表達并可能作為潛在的轉(zhuǎn)移標志物。質(zhì)譜分析鑒定出6個蛋白點，其中3個為肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin的不同亞型，Transgelin作為單一標志物預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面

9、積(AUC)達86.8％(P=0.002)。
　　 3.免疫組織化學染色在結(jié)直腸癌組織芯片(共94例)中證實，Transgelin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的陽性表達較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者更常見(P=0.036)。
　　 4.根據(jù)8號染色體短臂雜合子缺失(LOH)和雜合子保留(ROH)將結(jié)直腸癌標本分為兩組，通過LCM/2D-DIGE發(fā)現(xiàn)89個蛋白點在兩組之間呈差異表達。質(zhì)譜分析鑒定出26個蛋白點，其中14個蛋白點在

10、8p LOH標本中高表達，12個蛋白點呈低表達。在14個高表達的蛋白點中，有2個點被鑒定為Transgelin。
　　 5.在結(jié)直腸癌標本及相應(yīng)的正常粘膜之間的差異蛋白質(zhì)組分析中，發(fā)現(xiàn)424個蛋白點呈差異表達，質(zhì)譜分析鑒定出56個蛋白點，其中24個蛋白點在結(jié)直腸癌標本中高表達，32個蛋白點低表達。
　　 6.利用miRNA技術(shù)靶向下調(diào)Transgelin表達，建立HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD結(jié)

11、腸癌穩(wěn)定細胞系，其Transgelin mRNA及蛋白質(zhì)水平較相應(yīng)的對照穩(wěn)定細胞系下降80～90％。
　　 7.下調(diào)Transgelin使HCT116細胞的侵襲能力下降>50％(P<0.01)，SW480細胞的侵襲能力下降27％(P<0.01)。轉(zhuǎn)染TAGLN突變體質(zhì)粒使Transgelin重新恢復表達后，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD細胞的體外侵襲能力分別上升57％和50％(P<0.01)。
　

12、　 8.HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD細胞分別較相應(yīng)的對照細胞HCT116CTRL和SW480CTRL的集落形成數(shù)目減少55％和40％(P<0.01)。
　　 9.誘導Anoikis凋亡后，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD細胞發(fā)生凋亡的比例分別為相應(yīng)的對照細胞系的1.4倍和1.8倍(P<0.01)，將細胞重新接種到常規(guī)培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，HCT116TAGLN-KD

13、和SW480TAGLN-KD細胞的存活數(shù)量僅為相應(yīng)對照細胞系的60～70％(P<0.01)。
　　 10.在HCT116細胞中，下調(diào)Transgelin能促進上皮標志物occludin的表達，降低間質(zhì)標志物vimentin和fibronectinl的表達；在SW480細胞中，下調(diào)Transgelin僅降低fibronectinl的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用LCM/2D-DIGE定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜

14、分析能發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌之間細微的蛋白質(zhì)表達差異。
　　 2.參與腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白絕大部分是不相同的。
　　 3.肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌中較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者明顯上調(diào)，在染色體8p LOH的結(jié)直腸癌中與8p ROH相比亦呈上調(diào)趨勢，但在全部結(jié)直腸癌標本與正常粘膜的比較中，則無明顯表達差異。
　　 4.下調(diào)Transgelin降低HCT116和