祛痰化瘀通脈方抗動脈粥樣硬化分子機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是膽固醇大量堆積于血管壁形成粥樣硬化斑塊，使血管壁增厚和管腔狹窄的一種慢性炎癥改變，當斑塊破裂或繼發(fā)血栓形成后，則轉為急性缺血性臨床事件，嚴重危害人類健康。
　　小窩(caveolae)是細胞表面直徑為50～100 nm的胞膜穴樣內(nèi)陷，小窩蛋白-1(Cav-1)是caveolae的主要組成成分，它通過對多種細胞功能和多個信號轉導途徑的調節(jié)參與AS的形成和發(fā)展。Cav-1參與內(nèi)皮型

2、一氧化氮合酶(eNOS)的調節(jié)，內(nèi)皮細胞Cav-1可發(fā)揮eNOS負性變構調節(jié)劑的作用。血管內(nèi)皮細胞中NF-κB的激活是血管內(nèi)皮細胞受損的始動機制之一，NF-κB激活后可刺激血管內(nèi)皮細胞分泌多種細胞因子，細胞間黏附分子(ICAM-1)是AS時內(nèi)皮細胞所表達的粘附分子，具有穩(wěn)定單核細胞和T淋巴細胞對內(nèi)皮細胞的粘附的作用。
　　中醫(yī)學認為“動脈粥樣硬化”屬于“瘀血”、“痰濁”的范疇，祛痰化瘀通脈方丹參為方中君藥，川芎、人參、山楂為臣藥，

3、黃連、澤瀉為佐藥，紅曲為使藥。該方具有益氣活血、化痰逐瘀功效，主治動脈粥樣硬化性冠心病痰凝血瘀證。我們前期實驗研究證實祛痰化瘀通脈方有顯著的抗AS作用，但是其作用機制尚未進行深入探討。因此，本課題以AS發(fā)病過程中的Cav-1/eNOS/NF-κ B通路為突破口，在此基礎上探討祛痰化瘀通脈方治療AS的作用機理，揭示該方的作用靶點及調控機制，為中醫(yī)藥防治AS提供新的思路和作用靶點。
　　目的:
　　通過痰瘀互結證AS冠心病小型豬

4、模型的整體實驗和ox-LDL損傷HUVECs的離體實驗，多層次、多水平探討祛痰化瘀通脈方防治AS的作用和分子機制。
　　方法:
　　1.整體實驗
　　采用高脂飼料喂養(yǎng)加介入冠狀動脈拉傷術建立痰瘀互結證AS冠心病小型豬動物模型，實驗共分為8組：正常對照組；痰瘀互結證AS冠心病模型組；祛痰化瘀通脈方高、中、低劑量組；丹蔞片組；舒降之組；生脈膠囊組。各組于術后共連續(xù)給藥8周，光鏡觀察冠狀動脈病理學變化；于0周、高脂2周、高脂

5、6周(藥后4周)、高脂10周(藥后8周)測定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C及TC/HDL-C比值均水平；免疫組化法檢測冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞Cav-1蛋白表達和NF-κB p65核移位變化；Western blot檢測冠狀動脈eNOS和ICAM-1蛋白表達。
　　2.離體實驗
　　在HUVECs原代培養(yǎng)、傳代、鑒定成功的基礎上，選擇2～5代細胞進行實驗。實驗分為6組：正常對照組；ox-LDL模型組；祛痰

6、化瘀通脈方高、中、低劑量組；舒降之組。各組加入相應含藥血清(正常組和模型組加入20％正常大鼠血清)預孵育2 h后，加入100 mg/Lox-LDL(正常組除外)刺激3 h或24 h后進行各項指標測定。MTT法檢測細胞活力；Real time RCR法檢測細胞Cav-1、eNOS、NF-κB p65和ICAM-1 mRNA表達；Western blot檢測細胞Cav-1、eNOS和ICAM-1蛋白表達；Griess法檢測細胞上清中NO含量

7、變化；免疫熒光法檢測細胞NF-κB p65核移位變化。此外，應用Cav-1抑制劑β-甲基環(huán)糊精(β-MCD)，考察Cav-1是否參與ICAM-1的表達。β-MCD預孵育2 h后100 mg/L ox-LDL刺激24 h，Western blot檢測細胞ICAM-1蛋白表達。
　　結果:
　　1.整體實驗
　　(1)與正常組相比，模型組小型豬冠狀AS形成，內(nèi)膜厚度、管壁狹窄率及內(nèi)膜厚度/中膜厚度比值均明顯增加(P<0.0

8、1)。與模型組相比，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組，丹蔞片組及舒降之組冠狀動脈病變程度明顯減輕，其內(nèi)膜厚度、管壁狹窄率及內(nèi)膜厚度/中膜厚度比值均明顯小于模型組(P<0.05～0.01)；祛痰化瘀通脈方低劑量組和生脈膠囊組與模型組比較均無明顯差異。
　　(2)高脂10周，與正常對照組比較，模型組血清TG、TC、LDL-C、VLDL-C及TC/HDL-C比值均明顯增加(P<0.05～0.001)；與模型組相比，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組、

9、丹蔞片組及舒降之組血清TG、TC、LDL-C、VLDL-C均明顯降低(P<0.05～0.01)，祛痰化瘀通脈方低劑量組TC、VLDL-C也明顯降低(P<0.05)，生脈膠囊組僅VLDL-C明顯降低(P<0.001)，其它血清脂質指標與模型組比較均無明顯差異。
　　(3)與正常組比較，模型組小型豬冠脈Cav-1蛋白表達和NF-κB p65核移位明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組，丹蔞片組及舒降之組Ca

10、v-1蛋白表達和NF-κB p65核移位均明顯降低(P<0.05～0.01)；祛痰化瘀通脈方低劑量組和生脈膠囊組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。
　　(4)與正常組相比，模型組小型豬冠脈eNOS蛋白表達顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，祛痰化瘀通脈方中劑量組、丹蔞片組及舒降之組eNOS蛋白表達顯著上升(P<0.01)，祛痰化瘀通脈方高、低劑量組和生脈膠囊組eNOS蛋白表達與模型組比較均無明顯差異(P>0.05)。

11、r>　　(5)與正常組相比，模型組小型豬冠脈ICAM-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組，丹蔞片組，舒降之組和生脈膠囊組ICAM-1蛋白表達顯著上升(P<0.05～0.01)，祛痰化瘀通脈方低劑量組和模型組比較無顯著差異(P>0.05)。
　　2.細胞實驗
　　(1)HUVECs經(jīng)100 mg/L ox-LDL刺激后細胞活力顯著活性降低(P<0.01)；加入不同劑量祛痰化瘀通脈方和舒

12、降之含藥血清后，細胞活力明顯升高(P<0.05～0.01)，祛痰化瘀通脈方三個劑量組存在一定量效關系。
　　(2)與正常組相比，模型組細胞Cav-1 mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各組細胞Cav-1 mRNA和蛋白表達顯著下降(P<0.05～0.01)。
　　(3)與正常組相比，模型組細胞eNOS mRNA和蛋白表達明顯低于正常組(P<0.01)；與模型組相比，各組細胞eNOS mRNA表達均明顯

13、上升(P<0.05～0.01)，其中以舒降之和祛痰化瘀通脈方高、中劑量組作用更為顯著(P<0.01)。
　　(4)與正常組相比，模型組細胞NF-κB p65mRNA表達和核移位顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，各組細胞NF-κB p65mRNA表達和核移位均低于模型組(P<0.05～0.01)。
　　(5)與正常組相比，模型組細胞ICAM-1 mRNA和蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，各組細胞ICAM-

14、1mRNA表達和核移位均低于模型組(P<0.05～0.01)。
　　(6)與正常組相比，模型組細胞上清液中NO含量明顯低于正常組(P<0.01)，與模型組相比，各組細胞上清NO含量顯著高于模型組(P<0.05)，其中舒降之組和祛痰化瘀通脈方高、中劑量組作用更加顯著(P<0.01)。
　　(7)與正常組相比，模型組細胞ICAM-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)，單獨應用10-3mol/Lβ-MCD則對正常細胞ICAM-1蛋白

15、表達無影響(P>0.05)。與模型組相比，10-3mol/Lβ-MCD預孵育組ICAM-1表達明顯降低(P<0.05)
　　結論:
　　1.祛痰化瘀通脈方可顯著降低痰瘀互結證AS冠心病小型豬血脂水平，明顯減輕冠狀動脈AS病變程度，其機制與下調Cav-1表達和上調eNOS表達，抑制NF-κB活化和降低ICAM-1表達有關。
　　2.祛痰化瘀通脈方可提高ox-LDL損傷后血管內(nèi)皮細胞活力，其作用機制與調節(jié)Cav-1/eNO