GAM材料促進(jìn)自體前交叉韌帶移植物愈合的體內(nèi)外研究.pdf

1、用各種自體肌腱移植物替代重建前交叉韌帶即使經(jīng)過比較長(zhǎng)的時(shí)間移植物和宿主之間也很難完全愈合，仍然存在自體肌腱移植物松弛和斷裂的嚴(yán)重并發(fā)癥。無論是采用自體還是異體移植物，在重建術(shù)后其愈合和再塑形過程都基本相似，都要經(jīng)歷移植物壞死、細(xì)胞重新移居、血管重建和再塑形四個(gè)階段。取半腱肌腱后觀察其再生時(shí)間，組織學(xué)及免疫組化結(jié)果證實(shí)，再生組織的確為新生肌腱，因其具有正常的腱細(xì)胞形態(tài)和腱組織結(jié)構(gòu)，且主要成分由Ⅰ型膠原組成。雖然新生肌腱具有正常的組織結(jié)構(gòu)，

2、但氨基葡聚糖和膠原的含量顯著低于正常腱組織，肌-腱連接處細(xì)胞排列紊亂無序，其直徑也明顯小于對(duì)側(cè)肌腱。雖然再生腱組織能夠?qū)⑼饬鲗?dǎo)通過肌-腱連接處，但其傳導(dǎo)速率明顯低于正常，最大抗?fàn)坷σ仓挥姓５?2％，生物學(xué)功能方面明顯弱于正常肌腱。
　　 研究表明，局部應(yīng)用外源性細(xì)胞因子，可明顯增加韌帶的強(qiáng)度、剛度和抗拉斷能量。但由于細(xì)胞因子多為高分子蛋白，在生物內(nèi)環(huán)境代謝快，生物利用度低，且有一定的免疫原性，這些缺點(diǎn)防礙了它在體內(nèi)的局部應(yīng)

3、用。基因質(zhì)粒使細(xì)胞因子以DNA的形式儲(chǔ)存在載體中，不易受各類蛋白酶的水解，更穩(wěn)定，免疫原性更低，療效也更持久，可以在內(nèi)環(huán)境中持續(xù)高水平地表達(dá)數(shù)周之久。傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染方法主要是將宿主體內(nèi)的種子細(xì)胞取樣在體外培養(yǎng)一段時(shí)間，適當(dāng)?shù)貍鞔笈c目標(biāo)基因在體外轉(zhuǎn)染然后再回植體內(nèi)，其工藝步驟，經(jīng)濟(jì)代價(jià)高昂，而且操作周期過長(zhǎng)，不適合韌帶急性損傷修復(fù)的病理特點(diǎn)。
　　 近年來，一些提出“原位組織工程”的概念作為可能的解決方案，并且已成為基因治療和組

4、織工程的一個(gè)重要研究方向。原位組織工程的基本理念是將生物材料與質(zhì)粒DNA相結(jié)合，形成一個(gè)基因局部釋放系統(tǒng)，即“基因活化基質(zhì)”(gene activated matrix，GAM)，將該基質(zhì)材料植入組織缺損處，當(dāng)內(nèi)源細(xì)胞爬入后，細(xì)胞被質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分泌質(zhì)粒編碼的組織修復(fù)蛋白因子，成為體內(nèi)局部生物反應(yīng)器，從而促進(jìn)組織的重建，這種載有質(zhì)粒DNA的生物材料，也被稱之為“局部基因釋放載體”(local gene delivery carrier)。<

5、br>　　 作者認(rèn)為采用基因活化基質(zhì)技術(shù)，通過較長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較，從組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)水平評(píng)價(jià)不同處理自體移植物的愈合轉(zhuǎn)歸，可為尋找優(yōu)化自體移植肌腱韌帶化的生物學(xué)新方法提供研究資料，從而降低前交叉韌帶重建術(shù)后自體移植物松弛斷裂的發(fā)生率，提高手術(shù)療效。
　　 目的:
　　 1、探討真核表達(dá)載體EGFP-N1-TGF-β1在成纖維細(xì)胞(GF)中的表達(dá)能力。
　　 2、完成兔前交叉韌帶重建動(dòng)物模型的構(gòu)建及鑒定，了

6、解GAM材料應(yīng)用于動(dòng)物模型后各時(shí)段肌腱移植物愈合的實(shí)際效能。
　　 3、了解兩組動(dòng)物移植物愈合過程中的組織學(xué)形態(tài)變化，比較其膠原表達(dá)情況和細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的差異性。
　　 方法:
　　 1、應(yīng)用基因重組技術(shù)和限制性內(nèi)切酶酶切構(gòu)建并鑒定EGFP-N1-TGF-β1真核表達(dá)載體，體外培養(yǎng)兔成纖維細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后以陽離子脂質(zhì)體：EGFP-N1-hTGF-β1為3μL∶1μ g的比例轉(zhuǎn)染，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通

7、過RT-PCR和熒光法檢測(cè)TGF-β1表達(dá)水平，利用水貂肺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制法檢測(cè)TGF-β1的生物學(xué)活性。
　　 2、將新西蘭大白兔48只隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)動(dòng)物中，移植物與GAM材料作用者為實(shí)驗(yàn)組(A組)，移植物未作處理者為對(duì)照組(B組)，每組動(dòng)物樣本數(shù)24例。手術(shù)切除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的前交叉韌帶，制作脛骨及股骨隧道，取自體半腱肌作為肌腱移植物，引入骨隧道，兩端縫合固定，完成前交叉韌帶重建。術(shù)后1月、3月、6月分別處死動(dòng)物取材。收獲肌腱

8、標(biāo)本，大體觀察肌腱移植物的形態(tài)，標(biāo)本用于生物力學(xué)測(cè)試，記錄最大斷裂負(fù)荷(負(fù)荷峰值)、斷裂時(shí)拉伸位移，應(yīng)力、應(yīng)變及彈性模量，并作出以上數(shù)據(jù)隨時(shí)間變化的關(guān)系圖譜。
　　 3、制備膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶重建模型，實(shí)驗(yàn)組給予生長(zhǎng)因子，對(duì)照組給予鹽水，分別于術(shù)后1個(gè)月，3個(gè)月和6個(gè)月，將韌帶移植物取出，通過光學(xué)顯微鏡和電鏡進(jìn)行肌腱組織學(xué)檢查，觀察其膠原表達(dá)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建含EGFP-N1-

9、TGF-β1基因的真核表達(dá)載體，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)了TGF-β1在轉(zhuǎn)錄水平mRNA的表達(dá)情況，熒光法檢測(cè)目標(biāo)基因成功轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，并持續(xù)4周以上，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清可有效的抑制水貂肺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 2、術(shù)后存活的動(dòng)物，收獲標(biāo)本時(shí)大體觀察無變異，僅發(fā)現(xiàn)對(duì)照組移植物斷裂1例，實(shí)驗(yàn)組組未發(fā)現(xiàn)移植物斷裂，移植物的總體成功率為97.9％。在術(shù)后1個(gè)月時(shí)間段內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的各項(xiàng)力學(xué)指標(biāo)差異無顯著性，在

10、術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肌腱標(biāo)本的最大斷裂負(fù)荷及彈性模量顯著大于對(duì)照組，p≤0.05，此時(shí)間段內(nèi)各組的其它力學(xué)指標(biāo)差異無顯著性。
　　 3、光學(xué)顯微鏡下見各時(shí)期對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量較少且膠原纖維排列紊亂，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，膠原纖維成分增多，形狀粗大且排列較規(guī)則，接近正常組織結(jié)構(gòu)。電鏡下見實(shí)驗(yàn)組各時(shí)期實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)較對(duì)照組有絲分裂活躍，出現(xiàn)代謝旺盛的成纖維細(xì)胞，纖維間隙內(nèi)有較多基質(zhì)成分，胞質(zhì)中可見較為豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

11、和線粒體。
　　 結(jié)論:
　　 1、重組真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，并能在成纖維細(xì)胞中表達(dá)TGF-β1mRNA，TGF-β1基因轉(zhuǎn)染可使成纖維細(xì)胞有效而穩(wěn)定的表達(dá)活性TGF-β1而產(chǎn)生生物效應(yīng)。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建兔前交叉韌帶重建動(dòng)物模型的手術(shù)方法與臨床實(shí)際情況相符，術(shù)后證實(shí)有很高的成功率，可用于前交叉韌帶愈合機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。GAM材料局部作用于肌腱移植物后，某些生物力學(xué)特性強(qiáng)于對(duì)照組，可提高目標(biāo)肌腱的愈合強(qiáng)度。