MicroRNA在輻射致癌中的作用及其輻射生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)亦稱微小RNA，是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA,它主要通過(guò)與其靶基因mRNA3'-UTR區(qū)(mRNA的3'非翻譯區(qū))互補(bǔ)配對(duì)，從而發(fā)揮沉默特定靶基因作用。越來(lái)越多的研究證據(jù)顯示，miRNA廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和病毒中，在人類等哺乳動(dòng)物中至少有三分之一的基因(大約1萬(wàn)多條基因)受miRNA調(diào)控。研究結(jié)果顯示，miRNA在生物體的發(fā)育、增殖、分化、凋亡、壽命、免疫反應(yīng)特別是腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮著極為重要且必不可

2、少的調(diào)節(jié)功能。隨著研究的深入，越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其中，大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。有很多學(xué)者認(rèn)為miRNA的改變可能在大量，乃至所有人類(及小鼠)腫瘤的病理生理中發(fā)揮著極為關(guān)鍵性的作用，甚至有人提出miRNA的異常是最重要腫瘤起源之因。
　　 輻射致癌效應(yīng)是電離輻射嚴(yán)重的遠(yuǎn)后效應(yīng)之一，也是廣大涉核職業(yè)人員和民眾十分關(guān)心的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室從1999年開(kāi)始進(jìn)行了輻射誘導(dǎo)腫瘤

3、的機(jī)理研究，我們通過(guò)改良分次照射誘導(dǎo)小鼠發(fā)生胸腺T淋巴瘤型白血病，成功建立了輻射致癌的Balb/c(和C57)小鼠模型，并研究了輻射誘導(dǎo)腫瘤過(guò)程中許多表達(dá)差異基因和差異蛋白的改變。然而以上研究主要是某些已經(jīng)功能明確的癌基因抑制基因在輻射致癌組織中的表達(dá)驗(yàn)證研究，離完全闡明輻射致癌發(fā)生的分子機(jī)制還有很大的距離。這里還要特別指出的是，電離輻射是已知的重要物理致癌因子，其誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制遠(yuǎn)未闡明，對(duì)輻射致癌機(jī)理的研究不僅具有重要的軍事應(yīng)

4、用價(jià)值，還有助于放射線的和平利用和我國(guó)核能事業(yè)的大發(fā)展，因此有必要利用當(dāng)代生命科學(xué)的新發(fā)現(xiàn)、新理論、新技術(shù)對(duì)輻射致癌機(jī)理進(jìn)行深入探索。特別是，關(guān)于miRNA在輻射致癌發(fā)生、發(fā)展中作用及通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)的方法預(yù)防和治療輻射誘導(dǎo)的腫瘤的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本文將就這一重要問(wèn)題進(jìn)行初步探討。
　　 第一部分、輻射致癌中差異表達(dá)miRNA的篩選及驗(yàn)證
　　 為探討輻射致癌組織與正常組織之間的miRNA表達(dá)譜差異，我們以輻射

5、致癌的Balb/c小鼠模型為研究對(duì)象，首先利用Affymetrix miRNA芯片檢測(cè)的方法檢測(cè)了不同輻射致癌組織與正常胸腺組織的miRNA表達(dá)情況。應(yīng)用聚類分析法發(fā)現(xiàn)，輻射致癌組織與正常組織的總體miRNA表達(dá)譜有非常明顯的差異；進(jìn)而應(yīng)用SAM軟件統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在各樣本中表達(dá)重復(fù)性較好、表達(dá)豐度高、差異2倍以上且P＜0.001的miRNA共68條，其中輻射致癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA有48條，下調(diào)20條。最后，我們通過(guò)擴(kuò)大樣本Real

6、 Time-PCR方法驗(yàn)證獲得了20條左右差異表達(dá)的miRNA。與對(duì)照正常胸腺組織相比，輻射致癌T淋巴瘤組織中上調(diào)最明確的miRNA是miR-762，miR-21，miR-17-92簇，miR-106-363簇和miR-23a/b等；而輻射致癌T淋巴瘤組織中下調(diào)最明確的miRNA是miR-200c，miR-486，miR-199a/b，miR-143，miR-152，miR-125b，miR-31，miR-26，miR-100和let-

7、7等。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輻射致癌組織有眾多miRNA的表達(dá)異常，且miRNA可能參與了輻射致癌的發(fā)生。
　　 第二部分、輻射致癌相關(guān)miRNA的作用初步探索
　　 鑒于大量研究結(jié)果表明，miRNA主要通過(guò)特異性抑制其靶基因3'UTR的方式來(lái)發(fā)揮其功能。因此靶點(diǎn)的鑒定研究是miRNA研究的核心工作之一，本部分工作中我們對(duì)部分輻射致癌相關(guān)miRNA的新靶點(diǎn)進(jìn)行了試探性的研究工作。
　　 1.miRNA23，輻射致癌

8、發(fā)病與診斷相關(guān)的新的miRNA分子標(biāo)簽。
　　 2.miR-21對(duì)抑癌基因Big-h3的影響及其對(duì)TGFβ通路的調(diào)節(jié)作用。
　　 3.靶向小鼠P16基因的microRNA的探索。
　　 4.miR-125和DNTT在輻射致癌過(guò)程中的作用。
　　 第三部分、調(diào)控miRNA表達(dá)治療腫瘤的初步探討
　　 采用先體外后體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)方法探討了部分miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。本部分實(shí)驗(yàn)中，我們針對(duì)輻射致癌組

9、織中下調(diào)表達(dá)的部分miRNA(例如miR-200c、miR-486、miR-199b、miR-193b、miR-143、miR-145、miR-125a/b、miR-31、miR-26a、miR-99a、miR-152、miR-29a和let-7e等)，通過(guò)對(duì)NIH3T3/A549/U87MG等細(xì)胞過(guò)表達(dá)以上部分miRNA的方法，探討上調(diào)miR-200c、miR-486、miR-125b、miR-199b、miR-193b、miR-14

10、3、miR-145和let-7e等miRNA對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖等功能的影響。結(jié)果顯示，這些miRNA中有數(shù)條可以明確抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期紊亂，增強(qiáng)DNA損傷Foci水平和抑制細(xì)胞的克隆形成率。進(jìn)而從中篩選出4條體外殺傷腫瘤細(xì)胞效果較強(qiáng)且有一定創(chuàng)新性的miRNA，即：miR-200c、miR-486、miR-143和miR-125b。構(gòu)建了過(guò)表達(dá)以上4條miRNA的腺病毒載體，計(jì)劃對(duì)荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤效果進(jìn)行檢

11、測(cè)，部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。
　　 第四部分、miRNA在放射生物學(xué)其它方面意義的初步探索
　　 本部分研究主要初步探索miRNA與輻射敏感性、輻射防護(hù)、腫瘤輻射增敏及放射損傷生物標(biāo)志物等方面的意義。初步結(jié)果有：miR-34a表達(dá)水平與正常細(xì)胞、組織及個(gè)體的電離輻射敏感性密切正相關(guān)；過(guò)表達(dá)miR-34a表達(dá)可以對(duì)腫瘤細(xì)胞U87產(chǎn)生顯著的輻射增敏效果，而抑制miR-34a表達(dá)可以對(duì)正常細(xì)胞293起到比較較好的輻射防護(hù)的效應(yīng)

12、；且miR-34a在輻射損傷后12小時(shí)的小鼠血清中表達(dá)上調(diào)，提示其可能成為新的福射損傷相關(guān)的診斷指標(biāo)。我們還對(duì)輻射致癌組織的輻射敏感性進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)輻射致癌組織對(duì)電離福射有一定的抗性，且其福射抗性與miR-34a無(wú)關(guān)，卻與其高表達(dá)癌基因Ras有關(guān);并且可特異性靶向Ras的miR-143和LET7也可以對(duì)U87MG細(xì)胞起到輻射增敏的效果。
　　 本課題的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　　 1.首次探討miRNA在輻射致癌中的作用并獲

13、得了輻射致癌組織的總體miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了部分輻射致癌組織差異表達(dá)的miRNA。
　　 2.首次對(duì)部分輻射致癌相關(guān)miRNA的功能進(jìn)行了初步研究；并首次克隆了多個(gè)輻射致癌相關(guān)重要基因的3'UTR區(qū)，構(gòu)建了以上3'UTR報(bào)告基因載體和部分點(diǎn)突變3'UTR報(bào)告基因載體。
　　 3.首次鑒定出靶向小鼠FAS3'UTR的miRNA miR-23，并對(duì)miR-23a和miR-23b對(duì)FAS的抑制作用差異性的分子機(jī)制進(jìn)行探

14、討；首次鑒定出靶向小鼠P163'UTR的miRNA，并發(fā)現(xiàn)體外和體內(nèi)靶向P163'UTR的miRNA差異；首次鑒定出靶向小鼠Big-h33'UTR的miRNA;首次鑒定出靶向小鼠B7H13'UTR的miRNA。
　　 4.首次對(duì)Tregs，MDSC和DC等重要細(xì)胞亞群在輻射致癌小鼠中的變化情況進(jìn)行研究。
　　 5.首次發(fā)現(xiàn)miR-21可以正反兩方向反饋調(diào)節(jié)TGFβ通路。
　　 6.首次發(fā)現(xiàn)DNTT分子的被抑制和啟

15、動(dòng)均是輻射致癌發(fā)生的必要條件。
　　 7.首次探討過(guò)表達(dá)部分miRNA對(duì)DNA損傷Foci水平的影響。
　　 8.首次構(gòu)建部分過(guò)表達(dá)特定miRNA的腺病毒載體并應(yīng)用于輻射致癌的體外、體內(nèi)治療和預(yù)防實(shí)驗(yàn)。
　　 9.首次探討miRNA23和作為輻射致癌的血清學(xué)診斷指標(biāo)。
　　 10.首次對(duì)輻射致癌組織的輻射敏感性及部分分子機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，microRNA在輻射致癌的發(fā)生中發(fā)揮