腸道病毒71型的相關(guān)研究探討-EV71 VP4基因的序列分析、蛋白表達(dá)及其與CA16 VP4的交叉反應(yīng)性分析-EV71 感染對宿主細(xì)胞DNA甲基化狀態(tài)的影響的初步探索.pdf

1、手足口病是一種常常能夠引起患兒發(fā)熱并輕度出疹的兒科常見病,是全球公共衛(wèi)生關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。近年來手足口病呈頻繁暴發(fā)流行的態(tài)勢,成為嚴(yán)重危害兒童健康的重要疾患之一。腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CA16)是其主要的兩個致病因子。被CA16所感染的患者多數(shù)癥狀輕微,預(yù)后良好。然而,EV71除了能夠引起較為普通的手足口病癥狀外,還能引起各種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,

2、如無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹等嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至心肌炎、肺水腫或肺出血,導(dǎo)致死亡。因此對其進(jìn)行深入的研究相當(dāng)必要和緊迫。VP4是EV71的外殼蛋白之一,它和VP1、VP2、VP3共同構(gòu)成了病毒的外殼,不同的是,VP1、VP2和VP3位于病毒外殼的外表面,而VP4則位于病毒外殼的內(nèi)表面,目前對于EV71的研究主要集中在VP1上,而對于VP4的研究則鮮有報道,其具體功能尚不明確,可能與病毒基因組RNA穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。近年來,

3、表觀遺傳學(xué)作為新興的領(lǐng)域倍受研究人員的廣泛關(guān)注,且在病毒的研究領(lǐng)域逐漸受到重視。
　　 為了弄清EV71 VP4基因變異趨勢及其與臨床癥狀之間的關(guān)系、EV71 VP4蛋白的抗原性及其與CA16 VP4蛋白是否存在交叉性反應(yīng),我們做了此項研究并試圖從表觀遺傳學(xué)的角度對EV71的致病機(jī)理進(jìn)行探索。本研究選擇分離自2007年～2009年因手足口病來首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院就醫(yī)的10例患兒的EV71毒株進(jìn)行相關(guān)研究,10株毒株的編號分

4、別為BJ25、BJ47、BJ4243、BJ65、B J67、BJ97、BJ110B、BJ110Y、BJ366和BJ374,其中BJ25、BJ47和BJ4243為從2007年病例中分離到的毒株,B J65、BJ67、BJ97、BJ110B和BJ110Y為從2008年病例中所分離到的毒株,余下的兩株則為從2009年病例中分離到的毒株,這10株毒株中編號為B J97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243的毒株為重癥病例中所分離,余下的為從

5、輕癥病例中所分離,首先對這10株毒株的VP4基因進(jìn)行了克隆測序,并運(yùn)用DNA-Star軟件中的EditSeq和MegAlign進(jìn)行分析,并將其中一株EV71 VP4基因克隆入PGEX-4T-1表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá),同時還表達(dá)了一株從手足口病患兒分離到的CA16毒株的VP4蛋白,運(yùn)用這兩個蛋白同時對189份正常人血清和20份腸道病毒感染患者急性期血清(10份為EV71感染患者急性期血清,另10份為CA16感染患者急性期血清)中的IgG進(jìn)行

6、Western Blotting檢測分析,并對26份腸道病毒感染患者急性期血清(14份為EV71感染患者急性期血清,另外12份為CA16感染患者急性期血清)中的特異性IgM也作了相應(yīng)的檢測分析。
　　 同時,以GAPDH基因為內(nèi)參,運(yùn)用染料法在實時PCR儀上檢測分析橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)感染EV71毒株BJ110B(重癥)后PCDH9、INSR、NKX-2-5和RASSF1A基因mRNA表達(dá)水平變化,并提取EV71感染前后的細(xì)胞

7、的DNA,經(jīng)重亞硫酸鹽處理后運(yùn)用克隆測序的方法(BSP)檢測PCDH9、INSR和NKX-2-5這三個基因啟動子區(qū)及其周圍甲基化水平變化,應(yīng)用甲基化特異性的PCR(MSP)檢測RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化水平,試圖從表觀遺傳學(xué)的角度對EV71感染的致病機(jī)理進(jìn)行初步的探索性研究。研究結(jié)果顯示,這10株EV71的VP4基因核苷酸序列同源性為94.2％-100.0％,從輕癥與重癥患者中所分離到的毒株之間的核苷酸的同源性很高,未見到一致的差異

8、出現(xiàn),其中分離自輕癥的B J67和分離自重癥的BJ110Y之間的核苷酸序列完全相同,說明臨床癥狀的輕重與VP4基因的核苷酸序列沒有明顯關(guān)系,三個年份之間的VP4基因的核苷酸同源性也很高,也未出現(xiàn)一致的差異,說明近三年所流行的毒株未出現(xiàn)明顯的變異;依據(jù)這10株毒株的VP4基因的核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列則完全相同,進(jìn)化樹分析表明北京這三年所流行的毒株屬于C4亞型。在用原核系統(tǒng)表達(dá)的EV71 VP4蛋白作抗原檢測189份正常人血清中特異性

9、IgG時,抗體陽性率為38.10％,低于相應(yīng)的EV71 VP1蛋白作抗原的抗體陽性率(64.55％),CA16 VP4蛋白的特異性抗體陽性率為58.20％,也低于相應(yīng)的CA16 VP1的抗體陽性率(75.13％);在檢測20份腸道病毒感染患者急性期血清中特異性IgG時,抗EV71 VP4蛋白的抗體陽性例數(shù)是3例,而抗相應(yīng)的EV71 VP1蛋白的抗體陽性例數(shù)是19例;抗CA16VP4蛋白的陽性例數(shù)是14例,抗相應(yīng)的CA16 VP1蛋白的陽

10、性例數(shù)是20例;在用于檢測26份腸道病毒感染患者急性期血清IgM時,兩者皆為陰性,而相應(yīng)的VP1的檢測結(jié)果則與感染狀況有很好的符合性。提示自然感染后病毒的VP1蛋白能夠更好地引起機(jī)體的抗體產(chǎn)生,而可能由于VP4在病毒外殼的內(nèi)側(cè)面,引導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的反應(yīng)更弱。RD細(xì)胞感染EV7140小時后PCDH9和NKX-2-5兩個基因mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)下降,但下降幅度不大,但I(xiàn)NSR和RASSF1A兩個基因表達(dá)上調(diào),INSR基因表達(dá)上調(diào)幅度較小,

11、而RASSF1A基因表達(dá)上調(diào)幅度相對較大;亞硫酸鹽處理后運(yùn)用BSP法對PCDH9啟動子區(qū)的-222bp～+268bp區(qū)域所進(jìn)行的研究表明此區(qū)域在RD細(xì)胞感染EV71前后均是未甲基化的,對此基因啟動子區(qū)的其他部分的研究正在進(jìn)行中,運(yùn)用BSP法對INSR和NKX-2-5兩個基因啟動子區(qū)的克隆測序尚在進(jìn)行中,運(yùn)用MSP法對RASSF1A啟動子區(qū)的研究顯示RD細(xì)胞感染EV7140小時后此基因啟動區(qū)出現(xiàn)了去甲基化的趨勢。綜上所述,可以看出北京地區(qū)

12、近三年來所流行的EV71毒株屬于C4亞型,與以往所報道的大陸其他地區(qū)所流行的毒株亞型的型別相同,從EV71 VP4基因核苷酸序列來看近三年來所流行的毒株未發(fā)生明顯的變異;在檢測人血清中的特異性IgG時,原核系統(tǒng)所表達(dá)的EV71 VP4蛋白有良好的抗原性,但其在檢測人群中的抗體陽性率卻低于相應(yīng)的抗EV71 VP1的陽性率,EV71 VP4和CA16 VP4可能沒有交叉性,在檢測EV71病毒急性感染期患者的血清特異性IgM時,用EV71 V

13、P4未能檢測到,這些可能與其所處的蛋白外殼的位置有關(guān),EV71 VP4位于蛋白外殼的內(nèi)表面而EV71 VP1則位于蛋白外殼的外表面;或者IgM抗體更加依賴于抗原的構(gòu)象。原核表達(dá)的EV71 VP4可能不適合用于對EV71既往感染的血清學(xué)診斷,也不適合于疾病的早期病原學(xué)診斷;EV71感染RD細(xì)胞后,RD細(xì)胞的PCDH9基因啟動子區(qū)的-222bp～+268bp區(qū)域的甲基化水平未受影響,RASSF1A基因的啟動子區(qū)卻有去甲基化的趨勢,且應(yīng)用實時