腸道病毒71型VP1基因的擴(kuò)增、克隆、表達(dá)及蛋白分析.pdf

1、目的：
　　腸道病毒71型(Enterovirus71EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus),是引起手足口病(HFMD)和無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎和髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病的主要致病菌。近年來(lái),手足口病發(fā)病率顯著升高,并呈現(xiàn)從季節(jié)性流行變?yōu)槿晟l(fā)的趨勢(shì)。EV71的VP1蛋白是該病毒的主要的病毒中和決定因子,它直接決定病毒的抗原性。因此,EV71VP1蛋白的抗原

2、性與其他生物學(xué)特性的研究具有重要的臨床意義。
　　本課題通過(guò)對(duì)腸道病毒71(EV71)VP1基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、序列分析、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、純化,并使用純化的重組蛋白通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassayELISA)檢測(cè)患者的免疫反應(yīng)性,為臨床診斷及疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　根據(jù)GenBank中EV71序列(EU703813.1)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,采取兒童

3、的咽拭子標(biāo)本,提取病毒核糖核酸,以此核酸為模板,RT-PCR擴(kuò)增EV71VP1。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHI和XhoI酶切,酶切產(chǎn)物純化后與相應(yīng)酶切純化的pET28a連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α,挑取卡那篩選陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒并用雙酶切鑒定。將鑒定后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21,經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定后,以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組菌表達(dá),并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG

4、E)及免疫印跡法(Westernblot)分析表達(dá)結(jié)果。并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,純化后的蛋白包被反應(yīng)板,用ELISA法分別檢測(cè)EV71陽(yáng)性與COXA16陽(yáng)性病人VP-1IgG抗體,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　以手足口病患兒咽拭子標(biāo)本提取的RNA為模板,RT-PCR獲得891bp的DNA片段,與預(yù)期目的片段大小一致,并將其成功克隆入pET28a載體。經(jīng)BLAST比對(duì)顯示基因同源性與GenB

5、ank登錄號(hào)為JQ766207.1一致性達(dá)99％。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得分子量約32KD的融合表達(dá)蛋白,與預(yù)期分子量相符。通過(guò)包涵體純化得到VP1高純度蛋白,以純化蛋白包被反應(yīng)板檢測(cè)EV71陽(yáng)性、COXA16陽(yáng)性病人的血清標(biāo)本,EV71陽(yáng)性病人OD值均值2.385±0.628,COXA16陽(yáng)性病人OD值均值1.231±0.428,正常對(duì)照組OD值均值0.384±0.128。EV71VP1蛋白檢測(cè)敏感性和特異性分別為83.3%和85%。