諾如病毒VP1蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)及產(chǎn)物分析.pdf

1、背景及目的:諾如病毒(norovirus，NoVs)是引起人類(lèi)散發(fā)和暴發(fā)流行腸胃炎的主要病原體，由于諾如病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)已被證實(shí)具有高度的免疫原性，目前正被廣泛用于諾如病毒疫苗的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。本研究利用臨床樣本提取的諾如病毒RNA構(gòu)建pPIC9K-VP1重組表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)諾如病毒VP1蛋白基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）中高效分泌表達(dá)，這些生產(chǎn)和純化系統(tǒng)可以用于大規(guī)模生產(chǎn)No

2、Vs-VLPs，為研發(fā)諾如病毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　方法:從2015年12月至2016年8月，收集海軍總醫(yī)院消化內(nèi)科門(mén)診成人急性非細(xì)菌性腸炎的糞便標(biāo)本和臨床資料，將樣本混懸液離心并收集上清液，并從上清液內(nèi)提取病毒RNA。通過(guò)對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增與測(cè)序，篩選諾如病毒的陽(yáng)性樣品并獲取目的基因。將NoVs-VP1蛋白基因插入質(zhì)粒pPIC9K，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-VP1，再將酶切后的線性化重組表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)

3、Pichiapastoris GS115。在發(fā)酵的最初階段分批地向培養(yǎng)基內(nèi)加入甘油，在甘油耗盡后，通過(guò)加入甲醇誘導(dǎo)VLPs表達(dá)。將搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)的上清液進(jìn)行超濾濃縮，用透析法脫鹽，通過(guò)離子交換色譜法純化，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE、TEM等鑒定。
　　結(jié)果:共收集到43例患者的糞便標(biāo)本和臨床資料，通過(guò)RT-PCR對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，得出基因片段長(zhǎng)1620個(gè)堿基，通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線BLAST分析，確定其基因型。選

4、取其中一份樣品(NoVs GⅡ-4型)，將目的基因NoVs-VP1克隆入表達(dá)載體pPIC9K中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后VLPs蛋白分泌至上清液中。在SDS-PAGE凝膠上顯示為表達(dá)產(chǎn)物VLPs所對(duì)應(yīng)的62 ku分子量條帶，使用抗NoVs血清Western Blot也于62 ku處顯示了陽(yáng)性條帶，確定VP1蛋白的完整表達(dá)，而VLPs的產(chǎn)量達(dá)到了1 g/L（經(jīng)純化后約為600 mg/L）。使用TEM觀察到產(chǎn)物顆粒的大小及形態(tài)特征，證實(shí)其為平均直徑約為4