血漿高分子量激肽原在內(nèi)毒素血癥中致病作用的初步研究.pdf

1、【研究背景和意義】血漿高分子量激肽原（high molecular weight kininogen, HK）是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Plasma kallikrein-kinin system, KKS）的主要成分之一。臨床研究表明，敗血癥患者中KKS被活化，而且HK被裂解，說明HK參與敗血癥的發(fā)病過程。但是，迄今對于 HK在內(nèi)毒素血癥發(fā)病中的作用完全不清楚。本研究使用遺傳學(xué)方法，對HK在內(nèi)毒素血癥中的作用進(jìn)行了系列研究。

2、　　【研究目的】認(rèn)識HK在內(nèi)毒素血癥中的致病作用及其對天然免疫的調(diào)控機(jī)制。
　　【研究方法】Kng1-/-小鼠和其同窩對照野生型小鼠腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)，觀察小鼠的生存率；應(yīng)用ELISA檢測血漿中緩激肽（BK）和炎癥因子的含量；應(yīng)用實時PCR檢測白細(xì)胞和單核細(xì)胞炎癥因子mRNA水平；制作主要器官的組織切片和掃描電鏡，觀察組織的病理改變；檢測支氣管肺泡灌洗液中炎性指標(biāo)變化。
　　【研

3、究結(jié)果】(1)應(yīng)用Western和RT-PCR發(fā)現(xiàn)Kng1-/-小鼠血漿中HK蛋白和肝臟中 HK mRNA表達(dá)均缺陷。Kng1-/-小鼠血漿活化部分凝血激酶時間與野生型小鼠相比顯著延長(56.81±5.428 v.s.33.64±2.288 seconds, p=0.0004)。(2) Kng1-/-小鼠和野生型小鼠腹腔內(nèi)注射LPS(50mg/kg)48小時后，Kng1-/-小鼠的存活率比野生型小鼠明顯提高(100%v.s.10%, p

4、<0.001)，提示Kng1基因的缺陷對LPS導(dǎo)致的死亡具有保護(hù)作用。(3)野生型小鼠在注射LPS3小時后，小鼠血漿中緩激肽含量比0小時明顯增高(7896±41.65 v.s.4476±15.14 pg/mL, p=0.0026)，提示LPS在體內(nèi)可以導(dǎo)致KKS系統(tǒng)的活化，裂解HK產(chǎn)生緩激肽。(4)在LPS注射4小時后，Kng1-/-小鼠血漿中炎癥因子的水平比野生型小鼠顯著降低(TNF-α:213.4±100.7 v.s.760.3±1

5、85.8 pg/mL，p=0.0322；IL-1β:138.9±27.19 v.s519.3±93.9 pg/mL, p=0.0092；IL-6:429.4±51.11 v.s722.1±96.49 pg/mL, p=0.0231)。(5)使用流式細(xì)胞儀分選出CD90, B220, CD49b, NK1.1, Ly-6G陰性表達(dá)和CD11b陽性表達(dá)的單核細(xì)胞，實時PCR檢測單核細(xì)胞炎癥因子mRNA水平。與野生型小鼠相比，Kng1-/-小

6、鼠單核細(xì)胞炎癥因子 mRNA水平顯著降低(IL-1β:0.622±0.077 v.s.2.674±0.174, p=0.0095;IL-6:0.454±0.048 v.s.3.255±1.028,p=0.0004)。(6)通過HE染色，電鏡觀察和檢測支氣管肺泡灌洗液評價小鼠急性肺損傷程度。從HE染色和電鏡中可以看出，野生型小鼠的肺組織間質(zhì)增生明顯，纖維細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤明顯，血管擴(kuò)張，提示出現(xiàn)典型的肺組織急性損傷，而 Kng1-/-

7、小鼠上述肺組織病理表現(xiàn)明顯改善。與野生型小鼠相比，Kng1-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量(0.0436±0.01341 v.s.0.1062±0.0093 ug/ul, p=0.0188)和總細(xì)胞數(shù)(0.7667×104±881 v.s.1.6×104±2640個,p=0.0404)明顯降低，肺組織髓過氧化物酶活性也明顯降低(680.5±116.2 v.s.1791±327.3 ng/mL, p=0.0127)。上述觀察提示Kng