羽扇豆醇酯對人食管癌TE-1細(xì)胞體外增殖抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、癌癥是指體細(xì)胞失去控制的,無限制的增殖,是嚴(yán)重危害人民身體健康的惡性疾病之一。目前癌癥的治療方法包括有手術(shù)切除藥物治療和放射治療等在內(nèi)的綜合治療。其中,新興抗腫瘤藥物的開發(fā)是當(dāng)前癌癥治療領(lǐng)域的熱點研究方向,大量天然藥物及合成藥物的相繼問世及應(yīng)用在一定程度上對于提高及改善癌癥的預(yù)防,治療及預(yù)后起到了重要作用。河北省是食管癌的高發(fā)區(qū),多年來我實驗室致力于抗食管癌藥物的開發(fā)與研究。羽扇豆醇酯(Lupeol)是從多種食物及抗腫瘤中草藥中提取的活

2、性成分,在體外對多種腫瘤細(xì)胞如肺癌、前列腺癌、黑色素瘤及白血病細(xì)胞均有較好的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。我實驗室在對食管癌細(xì)胞系的抗腫瘤效果篩查研究中發(fā)現(xiàn),羽扇豆醇酯對食管癌TE-1細(xì)胞具有明顯的體外增殖抑制效果,我們并對其藥物作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,為羽扇豆醇酯的臨床開發(fā)提供了理論依據(jù)。
　　 第一部分、羽扇豆醇酯對人食管癌TE-1細(xì)胞體外誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制研究目的:觀察不同濃度的羽扇豆醇酯體外作用TE-1細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)及超

3、微結(jié)構(gòu)的變化,檢測羽扇豆醇酯對TE-1細(xì)胞的增殖抑制效果,并從基因及蛋白水平探討其誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)理。
　　 方法:
　　 1.將不同濃度(25、50、10、150和200μM)的羽扇豆醇酯分別作用TE-1細(xì)胞24、48和72小時,四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測細(xì)胞增殖抑制率。
　　 2.50、100和150μM的羽扇豆醇酯分別作用TE-1細(xì)胞24小時,瑞式姬姆薩染色后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。<

4、br>　　 3.150μM羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48小時后,在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 4.采用RT-PCR方法檢測50、100和150μM的羽扇豆醇酯分別作用TE-1細(xì)胞48小時后,凋亡相關(guān)基因Caspase-3、-8、-9,Fas,Bax和Bc1-2表達(dá)的變化。
　　 5.采用western blotting方法檢測50、100和150μM的羽扇豆醇酯分別作用TE-1細(xì)胞48小時后,PARP

5、、Fas、Bax和Cyt-c蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)不同濃度(25、50、100、150和200μM)的羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞24、48和72小時后,與正常對照組相比,實驗組細(xì)胞增殖抑制率在25、50、100和150μM之間存在顯著性差異(P＜0.01)。
　　 2.50、100和150μM的羽扇豆醇酯分別作用TE-1細(xì)胞24小時,瑞式姬姆薩染色后在倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變

6、化,由原來的多邊形變?yōu)閳A形,細(xì)胞體積縮小,生長稀疏,可見胞質(zhì)濃縮等,對照組細(xì)胞形態(tài)均一,生長密集,未見明顯改變。
　　 3.150μM羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48小時后,在透射電子顯微鏡下觀察可見細(xì)胞膜增厚,染色質(zhì)高度濃縮,邊聚核膜下,厚薄不均,形成新月狀,部分核膜向外成銳角突起,胞質(zhì)中可見許多空泡。對照組細(xì)胞表面大量微絨毛,胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體。
　　 4.RT-PCR分析結(jié)果顯示,50、100和

7、150μM實驗組Caspase-3、-8,-9,Fas和Bax mRNA的表達(dá)水平均明顯高于對照組,Bc1-2 mRNA的表達(dá)水平低于對照組,具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5.western blotting檢測結(jié)果顯示,50、100和150μM實驗組細(xì)胞中PARP、Fas、Bax和Cyt-c蛋白的表達(dá)水平高于對照組,具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:羽扇豆醇酯可通過死亡配體途徑和線粒體途徑雙重通路

8、誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用。
　　 第二部分、羽扇豆醇酯對人食管癌TE-1細(xì)胞體外阻滯周期作用及其機(jī)制研究目的:檢測羽扇豆醇酯對TE-1細(xì)胞的周期阻滯作用,并從基因和蛋白表達(dá)水平探討其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度(50、100和150μM)羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞/48小時后細(xì)胞周期分布及凋亡情況。
　　 2.western blotting方法檢測50、

9、100和150μM羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48小時后,細(xì)胞周斯蛋白CyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4的表達(dá)變化。
　　 3.RT-PCR方法檢測50、100和150μM羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48小時后,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因p53表達(dá)的情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.流式細(xì)胞術(shù)顯示不同濃度(50、100和150μM)羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48小對后,處G0/G1期的細(xì)胞增加,G1期細(xì)胞比例明顯高

10、于對照組(P＜0.05),實驗組細(xì)胞凋亡率高于對照組(P＜0.05)。
　　 2.western blotting分析方法結(jié)果顯示,50、100和150μM羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48h后,實驗組CydinD1和CDK4蛋白的表達(dá)水平低于對照組(P＜0.05)。
　　 3.RT-PCR方法結(jié)果表明,50、100和150μM羽扇豆醇酯作用TE-1細(xì)胞48h后,實驗組p53 mRNA的表達(dá)水平高于對照組(P＜0.05)。<