人Il-21基因聯(lián)合γ射線照射對(duì)食管癌EC109細(xì)胞抑制作用的研究.pdf

1、目的：
　　惡性腫瘤是危害當(dāng)代人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾病之一，腫瘤治療方法包括傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療以及近年來(lái)興起的基因治療等。食管癌是全球第九大惡性疾病，在全球許多地區(qū)流行，特別是在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，放射治療是目前食管癌主要的、有效的、安全的手段之一。腫瘤的基因治療是用一定的方法把外來(lái)的基因(DNA)轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中，使其在腫瘤部位表達(dá)高濃度產(chǎn)物或在體外相關(guān)細(xì)胞內(nèi)重組后再導(dǎo)入體細(xì)胞中表達(dá)，抑制腫瘤惡性表型，選擇性殺傷腫瘤

2、細(xì)胞，對(duì)周?chē)＝M織無(wú)明顯毒副作用，達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。放療和基因治療兩者之間存在著相互增強(qiáng)的作用。其機(jī)理是射線照射后增加基因轉(zhuǎn)染的效率和(或)促進(jìn)基因的表達(dá)，另外基因轉(zhuǎn)染后可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)射線照射的敏感性。
　　白細(xì)胞介素21(IL-21)是 Julla等[1]2000年發(fā)現(xiàn)的γc家族細(xì)胞因子成員，主要由活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生。IL-21與IL-2、IL-15和IL-4高度同源。Parrish-Novak[2]等研究者

3、克隆了白介素21(IL-21)及其受體(IL-21R)的cDNA。人IL-21 cDNA的ORF編碼162aa多肽前體，其信號(hào)肽31aa，成熟蛋白131aa，推算其分子量15kD。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)含有IL-21基因的重組腺病毒載體(Ad-IL-21)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人食管癌細(xì)胞株EC109，觀察IL-21基因的抑瘤效應(yīng)，然后聯(lián)合γ射線照射，研究?jī)烧叩膮f(xié)同抑瘤作用，為食管癌的進(jìn)一步基因治療研究提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：

4、r>　　本實(shí)驗(yàn)將已構(gòu)建好的重組腺病毒Ad-IL-21基因于體外轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞株EC109，然后進(jìn)行6Gy137Csγ射線照射，Ad-lacZ的病毒滴度為1.4×1012pfu/ml，重組腺病毒Ad-IL-21的病毒滴度為9×1011 pfu/ml，感染率MOI值為100。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)為空白對(duì)照組、Ad-lacZ組和Ad-IL-21基因組、單獨(dú)照射組和Ad-IL-21基因聯(lián)合照射組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)聯(lián)合治療組)。用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)觀察IL-2

5、1基因聯(lián)合放療對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期、凋亡的影響。通過(guò)PCR及WesternBlotting鑒定Ad-IL-21在轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、食管癌EC109細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：空白對(duì)照組、Ad-lacZ組和Ad-IL-21基因組EC109細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染后第2天開(kāi)始，單獨(dú)照射組和聯(lián)合治療組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯緩慢，與Ad-IL-21基因組和Ad-lacZ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=145.269

6、，P<0.05)；聯(lián)合治療組與單獨(dú)照射組和Ad-lacZ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.907，P<0.05)。在轉(zhuǎn)染后第3天，Ad-IL-21基因組的細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始明顯比空白對(duì)照組和.Ad-lacZ組慢(F=7.181，P<0.05)，空白對(duì)照組與Ad-lacZ組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中聯(lián)合治療組細(xì)胞生長(zhǎng)最為緩慢。
　　2.食管癌EC109細(xì)胞周期和凋亡的情況：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Ad-lacZ組和空白對(duì)

7、照組相比，Ad-IL-21組、單獨(dú)照射組及聯(lián)合治療組EC109細(xì)胞停留在G1期的細(xì)胞增加，凋亡率增加。其中以聯(lián)合治療組G1期細(xì)胞所占比例最高，達(dá)到71.2％，凋亡率13.88％。
　　3.食管癌EC109細(xì)胞內(nèi)IL-21基因表達(dá)的變化：Ad-IL-21轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞后提取RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出預(yù)計(jì)的IL-21基因片段(493bp)，以GAPDH為對(duì)照(300bp)。經(jīng)Quantity one軟件進(jìn)行灰度分析，空白對(duì)照組、

8、Ad-IL-21基因組、聯(lián)合治療組的IL-21基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.16、0.34、0.39。Ad-IL-21組EC109細(xì)胞中IL-21基因表達(dá)量比空白對(duì)照組高，聯(lián)合治療組IL-21基因表達(dá)量最多，分別是Ad-IL-21組和空白對(duì)照組的1.1倍和2.44倍。
　　4.食管癌EC109細(xì)胞內(nèi)IL-21基因蛋白表達(dá)的變化：Ad-IL-21轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞后提取總蛋白，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-21基因蛋白的特

9、異性條帶出現(xiàn)在Marker標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子量15KD左右，以?xún)?nèi)參β-actin為對(duì)照，出現(xiàn)在42KD左右。利用灰度分析軟件Quantity one對(duì)蛋白印跡帶進(jìn)行分析：空白對(duì)照組、Ad-IL-21組、單獨(dú)照射組及Ad-IL-21聯(lián)合治療組IL-21的相對(duì)表達(dá)量為0.36、0.75、0.39和0.79。4個(gè)組均表達(dá)IL-21基因蛋白，Ad-IL-21聯(lián)合治療組IL-21表達(dá)量最高，Ad-IL-21組表達(dá)明顯比空白對(duì)照組高。
　　結(jié)論：<

10、br>　　1.重組腺病毒Ad-IL-21能抑制食管癌EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)與Ad-lacZ對(duì)照比較，表明對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用來(lái)自轉(zhuǎn)導(dǎo)的IL-21基因，而不是腺病毒載體本身。
　　2.Ad-IL-21組、單獨(dú)照射組及聯(lián)合治療組對(duì)EC109細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，聯(lián)合治療組具有協(xié)同作用，其抑制效應(yīng)最強(qiáng)。Ad-IL-21組、單獨(dú)照射組及聯(lián)合治療組阻滯食管癌EC109細(xì)胞周期于G1期，使細(xì)胞對(duì)射線更敏感，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合治療組凋亡率最

11、高，有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　3.經(jīng)RT-PCR及Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組、Ad-IL-21組、聯(lián)合治療組中的IL-21基因及蛋白表達(dá)量不同，重組腺病毒Ad-IL-21有效地轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，并且在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，聯(lián)合治療組的IL-21基因及蛋白表達(dá)量最高，結(jié)果說(shuō)明單獨(dú)IL-21基因?qū)κ彻馨〦C109細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，而聯(lián)合治療組抑瘤效應(yīng)最明顯，有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，為今后用于臨床惡性