突變的核因子抑制蛋白IκBαM在大鼠肝星狀細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)及其在TNF-α誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：建立一種分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠肝星狀細(xì)胞的簡便易行和高效可靠的方法，將IκBαM基因轉(zhuǎn)染入大鼠肝星狀細(xì)胞，并在其中穩(wěn)定表達(dá)。探討IκBαM表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞生長抑制和凋亡的影響 方法：采用肝離體膠原酶和鏈霉蛋白酶灌注消化，50×g低速離心去除肝細(xì)胞，密度梯度離心法分離HSC，采用臺盼藍(lán)染色排斥法鑒定細(xì)胞活率，Desmin加α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定HSC純度。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將IκBαM基

2、因真核表達(dá)載體pCMV-IκBαM導(dǎo)入大鼠肝星狀細(xì)胞中，采用G418篩選途徑得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細(xì)胞細(xì)胞，然后通過Westernblot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后大鼠肝星狀細(xì)胞中相應(yīng)IκBαM蛋白質(zhì)表達(dá)水平來反應(yīng)。首先用不同劑量TNF-α對先前培養(yǎng)成功的IκBαM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞組進(jìn)行誘導(dǎo)，并使用間接免疫熒光法和Westernblot方法檢測細(xì)胞中NF-κB/P65蛋白的表達(dá)，應(yīng)用MTT法測定細(xì)胞生長率，然后用Annexin

3、V-FITC和PI試劑分別進(jìn)行雙標(biāo)記利用流式細(xì)胞儀對兩組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測。 結(jié)果：采用本方法，每只大鼠的HSC得率為2.53×107個，細(xì)胞活率為93.8％。用desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定，HSC純度為95.8％，α-SMA鑒定為97.3％。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大鼠肝星狀細(xì)胞中證實有pCMV-IκBαM相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。轉(zhuǎn)染IκBαM的大鼠肝星狀細(xì)胞的組NF-κB蛋白的表達(dá)明顯被抑制，轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長明顯受到抑制，兩

4、者比較有顯著性差異。轉(zhuǎn)染IκBαM的大鼠肝星狀細(xì)胞有較高的凋亡率，而未轉(zhuǎn)染IκBαM的大鼠肝星狀細(xì)胞只有少許細(xì)胞發(fā)生凋亡，兩者比較有顯著性差異。 結(jié)論：改良的大鼠HSC分離培養(yǎng)方法簡便易行，在保證純度的同時，提高了得率和活率。采用Desmin聯(lián)合α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞純度，提高了鑒定的敏感性。IκBαM基因真核表達(dá)載體pCMV-IBαM成功轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞，并在細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)，為進(jìn)一步研究NF-κB和肝星狀細(xì)