原發(fā)性膽汁性肝硬化動物模型的建立及其免疫耐受相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種好發(fā)于成年女性的自身免疫性肝病，病因不明且發(fā)病率逐年上升。PBC患者的免疫系統(tǒng)對部分線粒體及細(xì)胞核抗原的免疫耐受遭到破壞，致使大部分患者的血清中出現(xiàn)抗線粒體抗體和抗核抗體，其中95％的患者血清中存在抗線粒體內(nèi)膜PDC-E2的自身抗體。此外，多數(shù)患者外周血存在PDC-E2自身反應(yīng)性T細(xì)胞，而正常人外周血無此類細(xì)胞。然而，什么原因?qū)е翽BC的免疫耐受平衡破

2、壞及T細(xì)胞的免疫耐受調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)和了怎樣的改變目前尚不清楚。 被自身抗原活化的T細(xì)胞通常經(jīng)由凋亡途徑被機(jī)體清除。在眾多的凋亡機(jī)制中，活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Activation induced cell death，AICD)是機(jī)體維持外周免疫耐受的重要機(jī)制，外周免疫系統(tǒng)通過誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化后凋亡可有效的控制其對人體的器官、組織等造成免疫損傷，阻止自身免疫病的發(fā)生。器官特異性自身免疫病是由逃逸于外周耐受清除的自身反應(yīng)性T細(xì)胞引起

3、的組織損傷和功能異常。PBC的病變特征即是肝內(nèi)匯管區(qū)大量的淋巴細(xì)胞浸潤，自身反應(yīng)性T細(xì)胞不斷破壞小膽管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致膽管逐漸減少，膽汁淤積并最終引起進(jìn)行性的肝臟損傷。 研究表明在PBC匯管區(qū)浸澗的T細(xì)胞中以CD4+T細(xì)胞居多，大約是CD8+T細(xì)胞的2.5倍，由此推斷CD4+T細(xì)胞可能在免疫炎癥中發(fā)揮重要作用。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)PBC患者匯管區(qū)表達(dá)IFN-γmRNA的細(xì)胞明顯增加，說明Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)在致PBC肝臟病變過

4、程中具有重要作用。 聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid，polyI：C)是Toll樣受體3(TLR3)的配休，可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-α)的分泌。研究表明polyI：C與自身免疫病的發(fā)生和進(jìn)展具有相關(guān)性。而IFN-α能夠刺激體內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子等，同時還可以刺激機(jī)體分泌抗核抗體、抗甲狀腺抗體、抗胰島細(xì)胞等多種自身抗體。1995年D'Amico等報(bào)道一例慢性丙肝(ch

5、ronic hepatitis C，CHC)患者在接受IFN-α治療的過程中出現(xiàn)PBC樣病變，血清堿性磷酸酶水平達(dá)到正常人的3倍以上，且出現(xiàn)抗線粒體抗體，同時匯管區(qū)出現(xiàn)單個核細(xì)胞浸潤。另外，Takii等通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)PBC患者匯管區(qū)單個核細(xì)胞中IFN-α表達(dá)較自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)和CHC患者顯著升高。 在臨床治療方面主要依靠藥物治療緩解病人的瘙癢、骨質(zhì)疏松、門脈高壓等并發(fā)癥，但

6、無法延長患者的生存年限，更不可能從根本上治愈該病。因此有必要從免疫耐受的角度出發(fā)，尋找更為有效的治療手段，從而在根本上治療PBC。 基于以上研究現(xiàn)狀，我們擬通過注射M2蛋白及polyI：C誘導(dǎo)建立PBC小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上對其外周血、脾臟、肝組織的的CD4+T細(xì)胞活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析，了解其外周免疫耐受機(jī)制，最后將PBC自身抗原M2與交聯(lián)劑ECDI及脾臟淋巴細(xì)胞并同作用，經(jīng)尾靜脈注射PBC小鼠誘導(dǎo)重建建外周免疫耐受，脫

7、察PBC小鼠的疾病進(jìn)展情況。旨在為進(jìn)一步研究PBC的免疫耐受機(jī)制及其免疫治療的探索提供思路。 第一部分 M2三聯(lián)體抗原的基因工程生產(chǎn) PBC的主要自身抗原是位于線粒體內(nèi)膜的丙酮酸脫氧酶復(fù)合體(PDC)、側(cè)鏈氧酸脫氫酶復(fù)合體(BCOADC)、2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體(OGDC)的E2亞基。本科室將以上三種主要自身抗原免疫優(yōu)勢表位基因重組后經(jīng)克降表達(dá)出三聯(lián)體抗原。為了建立PBC小鼠模型并進(jìn)行免疫耐受研究，我們通過大量發(fā)酵生

8、產(chǎn)獲得該抗原。首先以IPTG在試管及燒瓶中進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，條件成熟后進(jìn)行發(fā)酵罐大量發(fā)酵，最后以安瑪西亞蛋白純化儀純化獲得的蛋白。 結(jié)果表明，小量誘導(dǎo)時IPTG1mg/ml誘導(dǎo)4小時蛋白表達(dá)量明顯升高。之后以3.5L發(fā)酵罐大量發(fā)酵，2.5小時后溶氧量下降，此時開始添加補(bǔ)料。我們分別以葡萄糖和甘油作為補(bǔ)料提供碳源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甘油作為碳源時蛋白的表達(dá)量顯著高于葡萄糖碳源。發(fā)酵罐IPTG誘導(dǎo)6小時菌體密度最高，此后不再有明顯變化，溶氧

9、控制在30％以上，最大轉(zhuǎn)速達(dá)到500rpm/min，pH為6.8-7.4，最終菌體密度OD600達(dá)到12.7，濕菌重約30g。經(jīng)蛋白純化儀純化后得到的蛋白濃度為1.5mg/ml。 第二部分原發(fā)性膽汁性肝硬化動物模型的建立 PBC是一種慢性遷延性疾病，病程很長，且患者往往伴有病毒感染等其他病變，更為重要的是病變組織局限于肝臟，很難獲得足夠的組織用于研究。因此，短期內(nèi)建立一個有效的動物模型能夠從根本上解決以上問題。

10、 我們分別以M2抗原50μg和polyI：C5mg/kg、10mg/kg劑量免疫C57BL/6雌性小鼠，在不同時間段處死分離血清、肝、腎、腦、小腸、胃等組織進(jìn)行抗線粒體抗體、抗核抗體、堿性磷酸酶(AKP)、病理分析，觀察小鼠病變情況。同時對小鼠外周血細(xì)胞進(jìn)行流式分析，了解T細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白免疫組ANA陽性率為30％，AMA陽性率則高達(dá)80％，且滴度均＞1：100，對照組未見陽性結(jié)果；Polyl：C免疫后，陰性對照組、5mg

11、/kg、10mg/kg組 ANA分別在第12、8、4周時陽性率達(dá)到100％；對照組及5mg/kg組小鼠從注射第8周開始出現(xiàn)滴度＞1∶100的ANA，10mg/kg組小鼠則從第4周開始出現(xiàn)＞1∶100的ANA，而且polyI：C組小鼠均從注射第8周開始出現(xiàn)滴度為1∶10000的高滴度ANA；血清AMA檢測發(fā)現(xiàn)，對照組AMA均為陰性，5mg/kg組隨著注射時間延長陽性逐漸增增加，16周達(dá)到80％并保持不變，10mg/kg組小鼠在注射后的第4

12、周AMA陽性率即達(dá)到80％，但是隨著注射時間延長 AMA陽性率卻出現(xiàn)下降，第12周降至20％并保持不變。AMA抗體滴度：5mg/kg組高滴度抗體的小鼠數(shù)量隨物注射逐漸增加，而10mg/kg組則呈現(xiàn)下降趨勢。 肝組織H．E染色并對浸潤細(xì)胞數(shù)大于50的匯管區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以百分率表示，發(fā)現(xiàn)5mg/kg組小鼠浸潤的匯管區(qū)數(shù)量逐漸增加至第16周，16周與20周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而10mg/kg組第12周即達(dá)到穩(wěn)定水平，與16周和

13、20周比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陰性對照組小鼠肝臟匯管區(qū)均未發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。對腎臟、胃、大腦、小腸和心肌組織進(jìn)行H．E染色，顯微鏡觀察均未發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)；polyl：C組小鼠的血清ALP水平隨著藥物注射逐漸增加，5mg/kg組和10mg/kg組ALP水平均＞60U/L，而陰性對照組則存60U/L以下，且隨著時間的變化無明顯改變，5mg/kg組和10mg/kg組兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。M2免疫組小鼠未出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥改變

14、及血清AKP變化。各組小鼠的外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞分布比例各組之間沒有出現(xiàn)顯著差異(P＞0.05)，同時各組內(nèi)也沒有隨著時間發(fā)生變化。 polyI：C5mg/kg劑量注射得到的模型符合PBC實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)，具有良好的代表性，可用于后續(xù)研究。 第三部分PBC模型中細(xì)胞增殖及活化誘導(dǎo)凋亡研究 體內(nèi)T細(xì)胞活化誘導(dǎo)凋亡(activation induced cell death，AICD)是清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞

15、維持外周免疫耐受的重要機(jī)制，效應(yīng)性T細(xì)胞AICD缺陷可能會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。研究表明在PBC患者的匯管區(qū)存在著大量的Th細(xì)胞，尤以Th1細(xì)胞為主。 小部分我們以polyI：C5mg/kg劑量注射C57小鼠重新建立PBC小鼠模型，16周后分離淋巴細(xì)胞并以磁珠純化獲得肝臟、脾臟CD4+T細(xì)胞，以M2蛋白及ConA結(jié)合anti-CD3刺激細(xì)胞增殖及活化后調(diào)亡實(shí)驗(yàn)，并對調(diào)亡相關(guān)基因及信號蛋白 FLIP、caspase-8進(jìn)行檢測

16、。此外，為了了解M2蛋白是否對T細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，我們按照笫二部分的方法同時注射M2抗原。PBC組小鼠體內(nèi)存在大量自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，且肝內(nèi)居多；CD4+T淋巴細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)使得PBC小鼠模型淋巴細(xì)胞AICD明顯降低，最終導(dǎo)致外周免疫耐受平衡被破壞；FLIPL的表達(dá)增高可能是AICD受到抑制的重要原因并參與匯管區(qū)炎癥反應(yīng)，同時FasL和TRAIL mRNA表達(dá)降低可能也起到一定的作用。 第四部分重建外周免疫耐受抑制原發(fā)性膽

17、汁性肝硬化 原發(fā)性膽汁性肝硬化目前尚無十分有效的根治手段，只能針對患者出現(xiàn)瘙癢、骨質(zhì)疏松、高脂血癥、門脈高壓等并發(fā)癥進(jìn)行對癥治療，而對于晚期患者肝臟移植則是最佳治療措施。因此，從免疫學(xué)角度出發(fā)尋找更為有效的根治手段已經(jīng)迫在眉睫。我們將M2蛋白與新生小鼠的脾淋巴細(xì)胞及交聯(lián)劑ECDI共培養(yǎng)，形成抗原負(fù)載的淋巴細(xì)胞，隨后通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對PBC自身抗原的免疫耐受，同時注射polyl：C誘導(dǎo)PBC病變，對照組注射與牛血