羥基磷灰石納米介導(dǎo)NT-3基因治療豚鼠實(shí)驗(yàn)性感覺神經(jīng)性耳聾的研究.pdf

1、NT-3是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能維持的重要物質(zhì)，是內(nèi)耳發(fā)育最基本的營養(yǎng)因子之一，并且對后天性損傷的神經(jīng)元有保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)的作用。眾多研究已證實(shí)其對于內(nèi)耳興奮性損傷如缺血、噪聲損傷，以及氨基苷類耳毒性損傷等各種因素造成的耳蝸損傷有一定的保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)的作用。前期研究已證實(shí)直接將NT-3蛋白通過微量滲透泵鼓階灌注可減輕谷氨酸對豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞興奮性毒性損傷?；蚩寺『突蜣D(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展讓內(nèi)耳基因治療前景廣闊．目前常用的基因載體有病毒載體中

2、的單純皰疹病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒載體和非病毒載體中的陽離子脂質(zhì)體，前期研究發(fā)現(xiàn)攜帶NT-3的重組腺病毒pAdeasy-NT-3對海人酸(KA)興奮性毒性所造成的耳蝸形態(tài)學(xué)損害有明顯的保護(hù)作用，但它們固有的一些缺陷如免疫原性和致癌性等讓其在臨床上的應(yīng)用必將受到限制。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米顆粒的獨(dú)特性質(zhì)使其作為非病毒載體的應(yīng)用逐漸受到重視，目前國內(nèi)外尚無納米顆粒內(nèi)耳基因治療的報(bào)道，首次嘗試用羥基磷灰石納米顆粒(HAT)做載體向靶細(xì)胞

3、轉(zhuǎn)染NT-3基因，研究體外細(xì)胞水平其在在小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)和對生長的影響，同時(shí)經(jīng)外淋巴灌注途徑向?qū)嶒?yàn)性神經(jīng)性聾豚鼠內(nèi)耳轉(zhuǎn)染NT-3基因，研究其在活體狀態(tài)下對耳蝸神經(jīng)元的保護(hù)作用，為非病毒載體介導(dǎo)的內(nèi)耳基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果如下： 一、羥基磷灰石納米顆粒神經(jīng)營養(yǎng)素3轉(zhuǎn)運(yùn)載體的構(gòu)建 l、重組質(zhì)粒pEGFPC2-NT3構(gòu)建 針對人的NT-3DNA序列，設(shè)計(jì)了包含起始密碼子和終止密碼子的一對引物，分別在其5’端

4、加上XhoI及Pst I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增NT-3目的基因，將pEGFPC2載體和PCR擴(kuò)增片段分別用Xhol I和PstI限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌，篩選克隆雙酶切鑒定，送陽性克隆雙向測序證實(shí)重組質(zhì)粒pEGFPC2-NT3構(gòu)建成功。2、HAT結(jié)合保護(hù)DNA能力、生物相容性、轉(zhuǎn)染效率評價(jià)?；蜉d體最基本的條件就是DNA的結(jié)合和保護(hù)能力，為此進(jìn)行了不同PH值及不同濃度HP與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)

5、HAT在酸性和中性條件下能與pEGFPC<,2>-NT-3表達(dá)質(zhì)粒完全結(jié)合，但在堿性條件下不能與pEGFPC<,2>-NT-3結(jié)合。同時(shí)發(fā)現(xiàn)濃度過低時(shí)(≤125μg／ml)HAT混懸液與DNA結(jié)合能力稍差，在濃度為500μg／ml時(shí)與DNA完全結(jié)合，可能為最佳濃度。結(jié)合DNA后不能被DNase工消化，說明其具有保護(hù)DNA能力。將不同濃度的HAT(≤500μg／ml)與宮頸癌上皮細(xì)胞Hela共培養(yǎng)，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測其對宮頸癌上皮細(xì)胞He

6、la的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)其基本無細(xì)胞毒性。利用HAT介導(dǎo)帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pEGFPC<,2>-NT-3來檢測其體外轉(zhuǎn)染效率，通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，同時(shí)與脂質(zhì)體LP22000介導(dǎo)的同一基因的轉(zhuǎn)染效率比較，發(fā)現(xiàn)HAT比脂質(zhì)體L22000的轉(zhuǎn)染效率稍低，約15％。同時(shí)發(fā)現(xiàn)pEGFPC<,2>-NT-3融合蛋白在細(xì)胞的亞細(xì)胞定位，基本定位于細(xì)胞漿，與后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中NT-3免疫組化在SGCs中表達(dá)一致。應(yīng)用Wes

7、tern-blot印跡分析方法，分別用NT-3抗體和GFP抗體檢測pEGFPC<,2>-NT-3融合蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HAT和脂質(zhì)體均能介導(dǎo)pEGFPC<,2>-NT-3進(jìn)入Hela細(xì)胞并表達(dá)，其條帶大小約為41KD，與GFP和NT-3(13.6KD)的大小之和一致。 二、HAT／pEGFPC<,2>-NT-3小鼠原代螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGCs)體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 1、小鼠的原代螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定．

8、 成功進(jìn)行小鼠的原代螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)2h后大多數(shù)SGCs已貼壁，呈典型的圓形，胞體透明，胞漿均質(zhì)，折光好。24h后可見突起細(xì)長的雙極神經(jīng)元細(xì)胞和三極神經(jīng)元細(xì)胞。12d后SGCs數(shù)目減少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。用特異性的神經(jīng)元標(biāo)志物抗鼠的NFP200的單克隆抗體鑒定，SP法AEC染色發(fā)現(xiàn)SGCs其胞膜和軸突染成鮮紅色，胞漿無明顯染色，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，可明確為神經(jīng)細(xì)胞。 2、HAT介導(dǎo)pEGFPC2-NT

9、3轉(zhuǎn)染SGCs并表達(dá)及對細(xì)胞生長的影響 為了檢測HAT作為基因載體對神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，應(yīng)用帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pEGFPC<,2>-NT-3來檢測其體外轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸原代培養(yǎng)SGCs效率，通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，同時(shí)與脂質(zhì)體L22000介導(dǎo)的同一基因的轉(zhuǎn)染效率比較，發(fā)現(xiàn)HAT比脂質(zhì)體LP2000的轉(zhuǎn)染效率稍低，約為15％。 同樣應(yīng)用Western-blot用NT-3抗體檢測pEGF

10、PC<,2>-NT-3融合蛋白在SGCs內(nèi)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HAT和LP均能介導(dǎo)pEGFPC<,2>-NT-3進(jìn)入SGCs并表達(dá)蛋白質(zhì)，其條帶大小約為41KD。 轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后12dSGCs計(jì)數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)HAq、載體組(HAT／NT-3組)、122000載體組(LP／NT-3組)及空白組細(xì)胞數(shù)均下降，而前兩組較空白組輕，說明轉(zhuǎn)染NT-3對減輕SGCs的退行性變有效。 三、HAT介導(dǎo)pEGFPC2-NT3對豚鼠耳蝸實(shí)驗(yàn)性興奮毒性

11、損害的保護(hù)作用 選擇經(jīng)豚鼠耳蝸鼓階底回灌注4 mm01／L海人酸(KA)10ul，發(fā)現(xiàn)灌注1h后ABR聽閾與術(shù)前比有顯著性差異，說明實(shí)驗(yàn)性興奮毒性模型建模成功．在灌注KA后7d經(jīng)同一孔給予HAT或L22000介導(dǎo)的pEGFPC<,2>-NT-3，在給KA28d后再次檢測ABR，與給KA7d后比ABR聽閾降低，潛伏期縮短，振幅變大，而KA組(未給NT-3)ABR聽閾持續(xù)性提高，說明HAT和LP2000介導(dǎo)的NT-3基因進(jìn)入耳蝸后起

12、到了阻抑興奮性遞質(zhì)KA對聽力的損傷作用，且HAT和LP兩組差別不大。 同時(shí)用免疫組化方法檢測NT-3在耳蝸組織中的表達(dá)及分布，在HAT和L22000介導(dǎo)的pEGFPC<,2>-NT-3導(dǎo)入豚鼠耳蝸后7d，可檢測到耳蝸SGCs內(nèi)NT-3蛋白的表達(dá)較正?？瞻讓φ战M明顯增強(qiáng)，其胞漿內(nèi)均有強(qiáng)染色呈深棕色，同時(shí)與正?？瞻讓φ战M比較可見螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，形態(tài)改變，有空泡樣變。說明NT-3基因進(jìn)入SGCs并獲表達(dá)，而KA對SGCs造成了