三嵌段高分子骨組織工程支架材料的制備和生物相容性、細(xì)胞粘附性以及表面修飾研究.pdf

1、組織工程學(xué)是綜合應(yīng)用工程學(xué)和生命學(xué)的基本原理、基本理論、基本技術(shù)和基本方法，在體外預(yù)先構(gòu)建一個(gè)有生物活性的種植體，然后植入體內(nèi)，修復(fù)組織缺損，替代組織、器官的一部分或全部功能，或作為一種體外裝置，暫時(shí)替代器官部分功能，達(dá)到提高生活、生存質(zhì)量，延長生命活動(dòng)的目的。這一內(nèi)涵的核心是活的細(xì)胞、可供細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的支架材料以及細(xì)胞與材料的相互作用，這是組織工程學(xué)研究的主要科學(xué)問題。骨骼損傷、缺損是骨科每天都要面臨的臨床問題。用于骨缺損修復(fù)的植

2、骨術(shù)，在美國已經(jīng)成為僅次于輸血的組織移植術(shù)。由于自體植骨來源有限，又增加創(chuàng)傷，因而很多國家都采用同種異體骨移植術(shù)。與自體骨一樣，也存在來源困難，有免疫排斥反應(yīng)，傳播疾病等問題。進(jìn)入90年代，研究者已經(jīng)將跟多的注意力放在骨組織工程的研究上。Lang從新生小鼠中分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，與羥基磷灰石、明膠復(fù)合后植入同種小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能明顯提高新的骨組織重建。但Bagambisa發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞對材料有選擇性，因此，骨組織工程學(xué)研究主要集中在支架材料的構(gòu)

3、建、種子細(xì)胞的篩選和標(biāo)準(zhǔn)化，以及細(xì)胞與支架材料間作用機(jī)制的研究方面。目前用于骨組織工程的支架材料有天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料，如：珊瑚、甲殼素、膠原等，具有較好的細(xì)胞親和性，但由于天然材料的來源以及處理方法不同而造成材料的性能難以重現(xiàn)，而且天然材料的強(qiáng)度明顯不足，質(zhì)量和降解速率也難以控制，不能滿足骨組織工程支架材料的要求。合成高分子材料包括無機(jī)材料和有機(jī)高分子材料，可以通過控制制作工藝，合理的調(diào)節(jié)材料的組成，使材料性

4、能具有良好的重復(fù)性。無機(jī)高分子材料，如：羥基磷灰石、磷酸三鈣和生物活性玻璃等，具有良好的材料-細(xì)胞界面，但是無機(jī)材料的脆性大、材料不降解或降解速率難以控制；所以，它們在骨組織工程的應(yīng)用受到了限制。目前，在骨組織工程中研究最多的還是人工合成的可降解高分子材料，如：聚酯類、聚酸酐和聚丁二烯酸異丙酯等。其中，以聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及兩者的共聚物(PL6A)這類聚酯類可降解高分子材料的研究最為廣泛。但是這類材料存在對細(xì)胞的粘附

5、性較差以及分子鏈中缺乏活性功能基團(tuán)等問題。為此，我們和中山大學(xué)高分子研究所共同研制出一種新型支架材料——聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸(asparagicacid，Asp)-聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)(PLGA-[ASP-PEG])三嵌段共聚物，并進(jìn)行了一下三部分的實(shí)驗(yàn)研究： 一、三嵌段高分子骨組織工程支架材料的制備和生物相容性研究 三嵌段高分子骨組織工程支架材料的制備和生物相容性研究目的：制備三嵌

6、段高分子骨組織工程支架材料——聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇，并對此材料進(jìn)行生物相容性能評價(jià)。方法：通過本體開環(huán)共聚方法合成PLGA-[ASP-PEG]三嵌段共聚物，進(jìn)行紅外光譜(IR)和核磁共振氫譜(1HNMR)分析；分別進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)、細(xì)胞與材料的復(fù)合試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、過敏試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)以及體內(nèi)植入試驗(yàn)。結(jié)果：IR和1HNMR證明PLGA-[ASP-PEG]三嵌段共聚物形成；材料的毒性評級為0～1級；掃描電

7、鏡下觀察，細(xì)胞與材料表面緊密貼合，形態(tài)良好；溶血率為3.08％；無熱原反應(yīng)；過敏試驗(yàn)為0～1級；無急性全身毒性癥狀；體內(nèi)植入試驗(yàn)示隨著時(shí)間的延長材料周圍的炎性反應(yīng)逐漸減輕。結(jié)論：聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇具有良好的生物相容性。 二、三嵌段高分子骨組織工程支架材料的細(xì)胞粘附性研究目的：比較聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇和聚丙交酯-共-乙交酯材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附性，為骨組織工程支架材料的選擇提供依據(jù)。方法：利用高

8、溫顯微鏡測定兩種材料的表面接觸角(contactangles)；體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，然后分別接種至上述兩種材料上，測定細(xì)胞粘附率和細(xì)胞粘附力，并進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果：聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料的表面接觸角是63.3±2.554度，聚丙交酯-共-乙交酯材料的表面接觸角是67.5±2.470度；細(xì)胞粘附率分別為69.7％和61.3％；細(xì)胞粘附力分別為321.15±92.39×10-10牛頓和216.96±73.76×10-

9、10牛頓；掃描電鏡觀察結(jié)果為聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)明顯多于聚丙交酯-共-乙交酯材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)。結(jié)論：聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料的粘附性優(yōu)于聚丙交酯-共-乙交酯材料的粘附性，是一種理想的骨組織工程支架材料。 三、三嵌段高分子骨組織工程支架材料的表面修飾研究目的：用-RGD-肽對三嵌段高分子骨組織工程支架材料進(jìn)行表面修飾，并檢測其細(xì)胞粘附性。方法：利用異雙官能交聯(lián)劑heterob

10、ifunctionalreagentSulfosuccinimidy16-[3’-2-(pyridyldithio)-propionamido]hexanoate(Sulfo-LC-SPDP)將甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-脯氨酸-半胱氨酸多肽(GRGDSPC)固定在聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面，并進(jìn)行XPS檢測和表面接觸角測定；體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，接種至表面修飾的材料上，測定細(xì)胞粘附力，并和實(shí)驗(yàn)二對比。結(jié)