SDF-1修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定的研究.pdf

1、目的：造血微環(huán)境損傷是引起某些疾病及造血干細(xì)胞移植時(shí)造血重建不良的重要原因。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境的主要成分，對(duì)造血干/祖細(xì)胞的粘附作用是促使造血干/祖細(xì)胞回髓定植和進(jìn)一步增殖分化的基礎(chǔ)。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞(hemopoieticstemcells，HSCs)以外的另一種干細(xì)胞，不僅直接參與生成造血微環(huán)境支持造血，在適宜的條件下還可發(fā)

2、育、分化為具有支持造血功能的多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞。因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能等，是細(xì)胞替代和基因治療理想的細(xì)胞來(lái)源。尤其在造血干細(xì)胞移植過(guò)程中，可以糾正或改善造血微環(huán)境的損傷，從而促進(jìn)移植后造血和免疫功能的重建。 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor-1，SDF-1)主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，同時(shí)，BMSCs也可合成、分泌SDF-1，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分。人SDF-1基因定

3、位于10號(hào)染色體，根據(jù)其編碼氨基酸序列歸屬于趨化因子CXC亞家族，與其表達(dá)于造血干細(xì)胞表面的唯一受體CXCR4結(jié)合參與造血的調(diào)控。在造血干細(xì)胞動(dòng)員、歸巢、定植和增殖中發(fā)揮重要作用，并可單獨(dú)或協(xié)同G-CSF、TPO等細(xì)胞因子通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)維持造血干細(xì)胞的正常功能。 本實(shí)驗(yàn)在成功分離、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)和構(gòu)建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，將重組質(zhì)粒傳染入hBMSCs，并檢測(cè)其

4、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，為進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究SDF-1修飾hBMSCs對(duì)造血的支持作用奠定基礎(chǔ)。 方法： 一、共采集25例骨髓標(biāo)本，均取自第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院血液科15歲至40歲正常、缺鐵性貧血及特發(fā)性血小板減少性紫癜患者；攜帶SDF-1cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORT6載體購(gòu)自ATCC公司，Number：47612；pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。 二、通過(guò)密度為1.073kg/L的Perco

5、ll液，利用密度梯度離心法分離出人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)，通過(guò)貼壁篩選法建立hBMSCs的體外培養(yǎng)體系，并通過(guò)一系列檢測(cè)方法對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 三、XhoI/EcoRI雙酶切攜帶有SDF-1cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORT6獲取SDF-1cDNA片段，并將其定向克隆到pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體中，構(gòu)建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體。 四、脂質(zhì)體介導(dǎo)未去

6、內(nèi)毒素質(zhì)粒SDF-1-pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染hBMSCs，觀測(cè)內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞的影響；去內(nèi)毒素質(zhì)粒SDF-1—pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染hBMSCs，通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)和半定量RT-PCR法檢測(cè)其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。 五、通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的G418篩選濃度。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： 一、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征及鑒定：細(xì)胞主要呈“成纖維樣”，但體積較大、

7、形狀不規(guī)則、胞漿突起多，細(xì)胞核大而疏松，核仁明顯。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：CD34陽(yáng)性率2.09％、CD29的陽(yáng)性率94.46％；CD54及CD105表達(dá)陽(yáng)性(因其熒光分布區(qū)域和對(duì)照管細(xì)胞的熒光分布區(qū)域相重疊，不適宜用陽(yáng)性率表達(dá)，而是用熒光強(qiáng)度代表其抗原表達(dá)強(qiáng)弱：CD54為26.36；CD105為82.31)。細(xì)胞周期及透射電鏡檢測(cè)提示細(xì)胞處于相對(duì)原始狀態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：CD14、CD45、膠原蛋白Ⅱ呈陰性；CD106、CD166、纖維

8、連接蛋白、Vimentin及膠原纖維酸性蛋白(GFAP)呈陽(yáng)性。細(xì)胞化學(xué)染色：糖原染色呈強(qiáng)陽(yáng)性；堿性磷酸酶染色呈陰性。通過(guò)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)可誘導(dǎo)出成骨細(xì)胞。以上一系列檢測(cè)提示hBMSCs分離培養(yǎng)成功。同時(shí)，顯示hBMSCs可傳代培養(yǎng)，但是細(xì)胞逐漸出現(xiàn)老化現(xiàn)象，且不能凍存。 二、SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建：pCMV-SPORT6攜帶的SDF-1cDNA測(cè)序后定向克隆至pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體中，構(gòu)建

9、SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體；測(cè)序證實(shí)所攜帶的SDF-1cDNA與GeneBank公布序列一致，定向構(gòu)建的重組載體連接方向和開(kāi)放閱讀框正確，證明載體構(gòu)建成功。 三、未去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：因內(nèi)毒素的細(xì)胞毒性造成靶細(xì)胞大量死亡，轉(zhuǎn)染失敗。 四、去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后48小時(shí)置熒光纖維鏡下觀察：可見(jiàn)EGFP表達(dá)，提示載體基因轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞內(nèi)。 五、轉(zhuǎn)染前/后SDF-

10、1cDNA在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)情況的檢測(cè)：采用RT-PCR從mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin(587bp)作為內(nèi)參，經(jīng)quality-one軟件分析，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞SDF-1/β-actin的光密度比值分別為0.86和0.71。結(jié)果表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SDF-1-pIRES2-EGFP質(zhì)粒的hBMSCs的SDF-1mRNA表達(dá)增高約20％左右。 六、經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定G418篩選濃度：250μg/ml為第8天細(xì)胞全部死亡的最低

11、濃度，定為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選濃度。 結(jié)論： 一、建立了穩(wěn)定的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，按照此培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)可以成功獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 二、成功構(gòu)建了攜帶有neo基因及表達(dá)EGFP基因的SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體，可以用于轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 三、用所構(gòu)建的SDF-1-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)EGFP