溫病濕熱證模型制作及清熱化濕方對內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的動態(tài)干預(yù).pdf

1、1目的本課題以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為依據(jù)，采用多因素復(fù)合造模方法，通過觀察模型大鼠的免疫、代謝的變化，并通過方藥反證，對濕熱證模型進(jìn)行評價。以該模型為基礎(chǔ)，通過觀察細(xì)胞內(nèi)毒素特異性受體LBPmRNA、CD14mRNA、TLR4mRNA、NF-κBp65表達(dá)變化，深入探討濕熱致病機(jī)理及清熱化濕方的治療機(jī)制。 2方法模型制作方面，采用復(fù)合因素造模，用清熱燥濕方對模型進(jìn)行干預(yù)，分別運用放免法觀察SIgA、IL-1、TNF-a，GAS、MTL；

2、直接法測定HDL-c、LDL-c；定磷法測肝線粒體Na+-K+-ATPase活性，對濕熱證大鼠模型進(jìn)行評價。并采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測各組大鼠肝巨噬細(xì)胞LBPmRNA、CD14mRNA和TLR4mRNA表達(dá)；采用免疫組化技術(shù)檢測：各組大鼠肝巨噬細(xì)胞NF-κBp65活化，以明確清熱化濕方對模型大鼠內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號相關(guān)蛋白分子受體的靶點，從細(xì)胞分子生物學(xué)層次對濕熱致病機(jī)理進(jìn)行探討。 3結(jié)果3.1濕熱證模型的研制

3、結(jié)果表明，模型組大鼠的癥狀、體征變化，與中醫(yī)學(xué)濕熱證基本相符；模型組SIgA、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，與對照組比較無顯著性差異；模型組HDL-c、LDL-c水平非常顯著增高，與對照組比較HDL-c顯著增高；模型組MTL水平顯著升高，GAS水平顯著降低，與對照組比較無顯著性差異，而對照組與正常組比較無顯著性差異；模型組肝線粒體Na+-K+-ATPase活性非常顯著降低，與對照組比較無顯著性差異。同時方藥反證，使用清熱化濕方治療

4、后，上述指標(biāo)恢復(fù)正常，與正常組比較無顯著性差異。結(jié)果說明，濕熱證大鼠模型制作成功。 3.2清熱化濕方對濕熱證模型內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的動態(tài)干預(yù)在感染6小時、12小時、24小時等不同時相點模型組LBPmRNA、CD14mRNA、TLR4mRNA、NF-κB表達(dá)逐漸非常顯著增強(qiáng)；模型組在6小時、12小時、24小時等不同時相點之間比較均有顯著性差異，說明隨著病程的發(fā)展，濕熱模型LBPmRNA、CD14mRNA、TLR4mRNA、NF-κB表

5、達(dá)逐漸增強(qiáng)。12h治療組與模型組比較：CD14mRNA、TLR4mRNA、NF-κB表達(dá)減弱有非常顯著性差異，24h治療組與模型組比較：LBPmRNA、CD14mRNA、TLR4mRNA、NF-κB表達(dá)減弱有非常顯著性差異。且治療組12h與6h比較以及24h與12h比較，LBPmRNA、CD14mRNA、TLR4mRNA表達(dá)均顯著減弱，具有非常顯著性差異，但治療組6h或24h與正常組比較仍有極顯著性差異，說明LBPmRNA、CD14mR

6、NA、TLR4mRNA遏制衰減是一個緩慢的過程。而治療組NF-κB激活6小時、12小時、24小時各時相點間比較均無顯著性差異；且與正常組比較NF-κB激活均無顯著性變化。說明清熱化濕方對內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號及核因子NF-κB的激活具有較好的干預(yù)抑制作用，中止炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，限制急性炎癥反應(yīng)等作用。 4結(jié)論4.1溫病濕熱證模型研制的實驗研究實驗結(jié)果表明SIgA，TNF-，IL-1三者顯著性增高，具有廣泛病理生理效應(yīng)，是評價濕熱證模型研制

7、成功與否在免疫學(xué)方面三個最主要客觀指標(biāo)。其中SIgA升高而產(chǎn)生的各種病理生理效應(yīng)類似“濕”的特性；而TNF-，IL-1升高所產(chǎn)生的各種病理生理效應(yīng)似乎具有“濕熱”雙重特性。胃動素、胃泌素指標(biāo)異常所產(chǎn)生的病理生理效應(yīng)，會出現(xiàn)腹脹、納呆、大便溏、嘔惡等。肝線粒體Na+-K+-ATPase活性非常顯著降低，一方面說明濕熱證機(jī)體細(xì)胞的能量代謝極顯著性降低，可導(dǎo)致物質(zhì)(脂質(zhì))代謝異常；另一方面打破Na+、K+的動態(tài)平衡，致細(xì)胞組織水腫，使細(xì)胞組織

8、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；這些病理生理效應(yīng)，可較好地解釋濕熱證的所見身重肢倦，口渴，不欲飲水等。故上述客觀指標(biāo)，可較好地從免疫、生化等方面解釋濕熱證的臨床表現(xiàn)，符合中醫(yī)濕熱證的特征，說明了本模型是典型濕熱證大鼠模型。 4.2.2清熱化濕方對濕熱證模型內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的干預(yù)靶細(xì)胞LBP、CD14、TLR4等內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號適量表達(dá)及NF-κB激活既是濕熱病證的主要致病機(jī)理，又是濕熱病證的特異性指標(biāo)，清熱化濕方對濕熱證模型內(nèi)毒素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號LBPmRN