丙酮酸乙酯防治缺血性急性腎衰竭機(jī)制探討.pdf

1、急性腎功能衰竭(ARF)是一種常見且嚴(yán)重的臨床綜合征，預(yù)后不良且療效差強(qiáng)人意。近年在臨床研究中發(fā)現(xiàn)抗氧化治療能成功的防治ARF；動物實(shí)驗(yàn)中針對HO、NOS、PPARs系統(tǒng)及抗炎抗氧化應(yīng)激等途徑也進(jìn)行了大量有益的探索。這為有效干預(yù)缺血性ARF提供了新的思路。 丙酮酸乙酯(EP)是一種穩(wěn)定的親脂性丙酮酸衍生物，是被FDA列安全級別的物質(zhì)。晚近的研究顯示，EP能降低氧化應(yīng)激反應(yīng)及氧自由基導(dǎo)致的損傷，可以提高膿毒癥動物模型的存活率，在出

2、血性休克及急性胰腺炎模型中具有治療效果；而其他更多的實(shí)驗(yàn)顯示EP在腸系膜血管、肝、心肌等臟器缺血再灌注損傷性動物模型中具有保護(hù)作用；并觀察到其對膿毒血癥的急性腎衰竭也有益處。為此，本研究選取EP，明確其用于防治缺血性ARF的可能性，并進(jìn)一步探索EP作用的可能機(jī)制。 材料和方法 本研究采用組織學(xué)和分子生物學(xué)方法，對缺血再灌注(I／R)損傷的BABL／C小鼠及體外模擬缺氧狀態(tài)下的人近端小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)，觀察在不

3、同階段使用EP干預(yù)后的病理及功能改變。對工／R小鼠使用EP干預(yù)，觀察其對腎功能及腎臟病理變化的影響；TUNEL法檢測腎臟組織中的凋亡細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光PCR檢測炎癥因子IL-1β-TNF、TNF-α、IL-6、HMGBl及粘附分子ICAM-1的表達(dá)以及凋亡途徑Bcl-2、Bax、caspase-3基因的表達(dá)；Western-blot分析MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白ERK、P38、JNK表達(dá)的變化。運(yùn)用MTT、法檢測EP對缺氧狀態(tài)下HK-2細(xì)胞增

4、殖及LDH活性釋放的影響；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化。從中了解EP對缺血性ARF的作用及可能的機(jī)制。 結(jié)果1．丙酮酸乙酯對缺血性．ARF的防治作用 1.1體外實(shí)驗(yàn)：分別在急性缺血再灌注(I／R)腎損傷BABL／C小鼠前30分鐘和I／R后4、6、12小時(shí)使用40mg／Kg及100mg／Kg兩種劑量的EP。通過病理學(xué)檢查我們發(fā)現(xiàn)，I／R的小鼠發(fā)生了典型的急性腎功能衰竭，伴隨著血清BUN和CR的增高，腎臟組織中壞死和凋亡病變

5、共存。病變殃及小管上皮細(xì)胞，病變最重區(qū)為位于外髓質(zhì)。進(jìn)一步的超微結(jié)構(gòu)顯示，近端小管病變以壞死為主而遠(yuǎn)端小管則以凋亡為主；EP能明顯減輕小鼠腎臟病理損傷程度，同時(shí)血清中升高的BUN和CR亦能明顯降低，說明EP能有效防治BABL／C小鼠腎臟的I／R損傷。 1.2體外實(shí)驗(yàn)：MTT法發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下，EP對HK-2細(xì)胞的增殖無明顯影響，相反在高濃度(100M／ML)時(shí)卻表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)。同時(shí)，本研究還應(yīng)用Antimycin A與

6、deoxyglucose結(jié)合模擬體內(nèi)的缺血缺氧狀態(tài)。可以觀察到在低氧下HK-2細(xì)胞的增殖能力在不同時(shí)期均明顯受到抑制；而加入不同濃度的EP后可見，HK一2細(xì)胞的增殖與EP的濃度相關(guān)：1mM和O.1mM的EP對：HK-2細(xì)胞在化學(xué)性低氧狀態(tài)下有促進(jìn)作用；而100mM的EP同樣明顯抑制了細(xì)胞的增殖。使用1mM和O.1mM的EP，作用在化學(xué)性低氧的HK-2細(xì)胞，測定其上清中細(xì)胞損害的標(biāo)志物L(fēng)DH的活性，結(jié)果證實(shí)了低濃度EP對HK-2細(xì)胞的缺氧

7、損傷有顯著的保護(hù)作用。 2．EP防治缺血性ARF的機(jī)理探討2．1 EP防治對腎臟I／R損傷小鼠炎癥的影響2．1.1 EP對I／R小鼠腎組織炎癥因子mRNA表達(dá)的影響在本研究中我們使用Real-time PCR顯示在：I／R后，促炎癥因子IL一6、’TNF-α、IL一1β和粘附分子ICAM-1的表達(dá)明顯增高，晚時(shí)相因子HMGBl的水平也顯著提高。使用40mg／Kg劑量的EP治療，對上述因子的表達(dá)抑制明顯。 2．1.2

8、EP對I／R小鼠腎組織MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)的影響 Western blot研究發(fā)現(xiàn)，I／R后2小時(shí)，腎組織中磷酸化的ERK、P38和JNK等MAPK信號通路蛋白均表達(dá)升高；I／R前30分鐘劑量為40mg／Kg的EP干預(yù)能顯著降低磷酸化的JNK和P38，但對總胞內(nèi)ERK、P38與JNK的表達(dá)沒有影響。在進(jìn)一步觀察中發(fā)現(xiàn)I／R24h后磷酸化的ERK、P38及JNK的表達(dá)仍較sham組顯著增高；在I/R后4、6、12h分別使用40mg

9、/Kg的EP能明顯抑制上述三條途徑磷酸化蛋白的表達(dá)，同時(shí)對總胞內(nèi)激酶的表達(dá)也無明顯影響。2.2 EP防治對缺血性ARF凋亡的影響2.2.1 TUNEL染色顯示凋亡陽性的細(xì)胞在缺血再灌注損傷中的高表達(dá)。EP干預(yù)能抑制缺血再灌注24h后腎組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。實(shí)時(shí)RT-PCR顯示I/R小鼠腎臟中bax基因及相應(yīng)的caspase-3的表達(dá)明顯升高；在I/R．后4、6、12h后給藥均顯著下調(diào)了bax、caspase-3的表達(dá)；而在I/R前3

10、0分鐘的用藥則能顯著提高bcl-2基因的水平。 2.2.2本研究發(fā)現(xiàn)在化學(xué)性缺氧狀態(tài)下，Annexin V/FITC法檢測到HK-2細(xì)胞的晚期凋亡率顯著升高，0.1mM及1mM的EP作用能明顯降低HK-2細(xì)胞的早、晚期凋亡率。 結(jié)論 EP防治能改善急性腎缺血再灌注(I/R)BABL/C小鼠腎功能及病理改變，無論在I/R前及I/R后4、6、12h使用EP均有效。體外研究表明低濃度(1Mm/L、0.1mM/L)的

11、丙酮酸乙酯(EP)能促進(jìn)化學(xué)性低氧下HK-2細(xì)胞的增殖，并減少細(xì)胞的損傷。其防治缺血性ARF可能的機(jī)制有：1)EP能明顯抑制腎臟I/R損傷小鼠的炎癥反應(yīng)：EP能顯著下調(diào)I/R腎臟中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、HMGBl及粘附分子ICAM-1的表達(dá)；并顯著抑制了磷酸化MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白ERK、P38、JNK的表達(dá)。2)EP抑制缺血性ARF的凋亡：TUNEL法顯示EP治療能降低I／R腎臟中的凋亡細(xì)胞數(shù)；同時(shí)通過上調(diào)Bc1