肺炎支原體抗體膠體金法快速檢測(cè)試劑的研制與初步實(shí)驗(yàn)室考核.pdf

1、研制一種敏感、特異、快速并適用于基層單位應(yīng)用的膠體金法快速檢測(cè)試劑，用于人類(lèi)血清標(biāo)本中肺炎支原體特異抗體的檢測(cè)，從而診斷肺炎支原體感染。 肺炎支原體(Mp)是引起兒童和成人支氣管炎和原發(fā)性非典型肺炎的一種重要病原體，20％以上的社區(qū)獲得性肺炎是由Up引起的，并且已成為因重癥肺炎而住院的老年患者的重要病因。 支原體肺炎無(wú)典型的臨床體征，因此MP感染依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室。近年來(lái)雖然發(fā)展了一些臨床檢測(cè)的新方法，如實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)

2、，但MP特異性抗體檢測(cè)，仍是MP感染診斷的重要方法之一。 本研究采用滅活的Mp菌體純化抗原致敏硝酸纖維素膜，同時(shí)用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)作為探針，利用免疫層析原理研制MP抗體快速檢測(cè)膠體金試劑，用于MP肺炎診斷。本研究主要內(nèi)容包括：肺炎支原體滅活全菌體抗原的制備和檢定、抗原致敏的最佳濃度和條件的選擇、免疫膠體金探針最佳標(biāo)記劑量、以及所研制的免疫膠體金法快速檢測(cè)MP抗體試劑的初步考核。

3、 研究顯示，成功培養(yǎng)了肺炎支原體，并獲得了純化的MP滅活菌體抗原，通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到直徑大小約為0．31~m，呈亮綠色、邊界清晰的圓形顆粒的Mp滅活的完整菌體。根據(jù)顏色反應(yīng)，膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度為每ml膠體金溶液需要SPA5gg，最佳標(biāo)記量為每ml膠體金溶液需要SPA6pg。不同濃度Mp滅活菌體抗原溶液經(jīng)BIO-DOT型XYZ3000點(diǎn)樣儀致敏硝酸纖維素膜，結(jié)果觀察3mg／mlMp滅活菌體抗原致敏硝酸纖維素膜檢測(cè)帶的

4、顏色反應(yīng)最好。因此確定Mp滅活菌體抗原致敏硝酸纖維素膜蛋白濃度為3mg／ml。膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合一般在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏鹼的條件下比較牢固，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)選擇SPA標(biāo)記的最佳pH6．0。以保存液作對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定試驗(yàn)中膠體金標(biāo)記SPA探針在520nm處的A值為3．5l，在適宜的A值(2．5．10)范圍內(nèi)。膠體金偶聯(lián)SPA后在電鏡下觀察，可見(jiàn)金顆粒外周有明顯的低電子密度暈圈，表明金顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)。用該試紙檢測(cè)了88份肺炎患者血